Uncovering Transcriptional Heterogeneity during Vibrio cholerae Biofilm Development
Bakterielle Biofilme sind komplexe Gemeinschaften von Mikroorganismen, die in einer von den Zellen selbst produzierten Matrix leben und den Bakterien Überlebensvorteile in verschiedenen Umgebungen bieten. Sie spielen eine wichtige Rolle in natürlichen Kreisläufen, sowie in medizinischen und industri...
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| Main Author: | |
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | English |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2023
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Bakterielle Biofilme sind komplexe Gemeinschaften von Mikroorganismen, die in einer von den Zellen selbst produzierten Matrix leben und den Bakterien Überlebensvorteile in verschiedenen Umgebungen bieten. Sie spielen eine wichtige Rolle in natürlichen Kreisläufen, sowie in medizinischen und industriellen Kontexten. Im medizinischen Bereich können sie chronische Infektionen verursachen und eine erhöhte Antibiotikaresistenz aufweisen, was Behandlungsherausforderungen darstellt. Zwischen den einzelnen Zellen in bakteriellen Biofilmen entsteht aufgrund von Variationen in der Nährstoffverfügbarkeit, der Sauerstoffpenetration und der Struktur des Biofilms eine physiologische Heterogenität, die vielfältige Stoffwechselaktivitäten und spezialisierte Funktionen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft ermöglicht. Die zelluläre Heterogenität in Biofilmen wird intensiv untersucht. Die komplexe 3D-Struktur von Biofilmen stellt die Forschung aber vor Herausforderungen und trägt zu einem noch lückenhaften Verständnis der mikrobiellen Lebensgemeinschaften bei. Diese Dissertation konzentrierte sich auf die Entwicklung einer neuen Technologie zur Untersuchung der Heterogenität von Biofilmen des humanpathogenen Bakteriums Vibrio cholerae. Die entwickelte Methode basiert auf RNA-Sequenzierung von räumlich-zeitlichen Biofilm-Subpopulationen um Heterogenitäten auf transkriptioneller Ebene abzubilden. Die Dissertation ist in zwei Teile gegliedert.
Der erste Teil beschreibt die methodische Entwicklung der erforderlichen Schritte zur Generierung von räumlich-zeitlichen Biofilm-Transkriptomen. Eine zugängliche mikrofluidische Durchflusskammer, die eine einfache und homogene Flusskontrolle über eine große Oberfläche ermöglichte, wurde entworfen und für die Biofilmkultivierung verwendet. Um Transkriptome von Biofilmen zu verschiedenen Zeitpunkten der Biofilmentwicklung zu erhalten, wurde ein homogenes Wachstum von Biofilmkolonien durch die kombinatorischen Effekte von Genmanipulation des verwendeten Stamms und Oberflächenpassivierung der Durchflusskammer erreicht. Dadurch konnten ähnlich große Biofilme, die nebeneinander in einer Kammer gewachsen waren, zusammengeführt werden, um genug Zellmaterial für die RNA-Isolierung selbst von kleinen Biofilm clustern und Subpopulationen zu ermöglichen. Die langfristige Stabilisierung von mRNA in Biofilmen während der durchzuführenden Vorgänge wurde durch konstante Probenkühlung und eine optimierte RNA-Stabilisierungslösung realisiert. Um die Biofilmzellen mit einer Codierung zu versehen welche die räumliche Lage im Biofilm angibt, wurden die einzelnen Biofilmzellen durch eine komplexe Markierungsstrategie mit Fluorophoren markiert, die die Entfernung zur Oberfläche angibt. Schonende Sonikation erwies sich als effektiv für die Disruption von rugosen V. cholerae Biofilmen. Die durch Sonikation aus den Biofilmen freigesetzten Einzelzellen wurden mittels Durchflusszytometrie (FACS) basierend auf ihrer Markierung, die die ursprüngliche räumliche Lage innerhalb der Biofilme kodierte, sortiert. Um Vergleichbarkeit von Mikroskopiedaten und FACS-Daten zu erreichen, wurde ein speziell für diese Anwendung angepasster Kalibrierungsprozess zwischen den beiden Instrumenten entwickelt. Es wurde eine Strategie zur langfristigen mRNA-Stabilisierung einzelner Zellen während der FACS-Sortierung eingeführt, und Experimente wurden durchgeführt, um die Aufkonzentration von mittels FACS sortierten Zellen zu optimieren. Die Anwendung des beschriebenen Protokolls führte zu insgesamt 135 räumlich-zeitlichen Biofilm-Transkriptomen, die jeweils aus 3647 Genexpressionsprofilen (95% aller V. cholerae-Gene) bestanden.
Der zweite Teil dieser Dissertation konzentriert sich auf die Analyse des präsentierten Datensatzes. Ein Verfahren zur Dimensionsreduktion zeigte, dass die Methode einen aussagekräftigen Datensatz lieferte, der zur Identifizierung räumlich sowie zeitlich regulierter Gene verwendet werden kann. Eine genaue Untersuchung der Expressionsmuster einzelner Gene ergab verschiedene zeitlich-räumliche Genexpressionsmuster. Die Daten stützen die Hypothese, dass Gradienten von Sauerstoff und anderen Molekülen treibende Kräfte für die Anpassung der Genregulation in Biofilmen sind. Im Weiteren fokussierte ich mich auf die Untersuchung von Teilen der Transkriptionsregulation des Glukosestoffwechsels, der Glykogenspeicherung und der Energieerzeugung. Die Ergebnisse suggerieren, dass V. cholerae Biofilme robuste Systeme zur Energieerzeugung im Kern des Biofilms haben, die nicht hauptsächlich auf anaerober Atmung beruhen. Die transkriptionellen Profile gaben einen klaren Hinweis darauf, dass die Glykogensynthese und -verwertung in Biofilmen eine Rolle spielt und möglicherweise eine wichtige Quelle für Glukose im nährstoffarmen Kern großer Biofilme ist. In genetischen Studien zeigte sich, dass eine reduzierte Expression von glgX das für ein Glykogen degradierendes Enzym kodiert, einen Wachstumsdefekt der Kolonien auf M9- und LB-Agarplatten verursachte. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Abbau von Glykogen eine wichtige Rolle bei der Koloniebildung von V. cholerae spielt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit einen großen Datensatz zur Transkriptionsregulation von V. cholerae in Biofilmen liefert, der das Potenzial hat, ein besseres und umfassenderes Verständnis der Lebensweise von Biofilmen zu fördern. Der Datensatz bildet eine Grundlage für die Untersuchung neuer Aspekte in der Biofilmforschung und bietet eine Basis für zukünftige Studien zur Biofilmbildung unter klinischen und umweltrelevanten Bedingungen. |
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| DOI: | 10.17192/z2024.0084 |