Systematische Analyse der Fitness-Effekte von TP53-Mutationen in Tumorzellen unter Nährstoffmangel und Aktivierung von p73

TP53 ist das am häufigsten mutierte Gen in menschlichen Tumoren. Mutationen des Tumorsuppressors p53 finden sich in fast allen Tumorentitäten, durchschnittlich in 50 % aller Patienten. Der Großteil der Mutationen sind einzelne Missense Mutationen, welche in der DNA-Bindungsdomäne liegen und zur Ausb...

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Main Author: Borowek, Anna
Contributors: Stiewe, Thorsten (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2023
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:TP53 ist das am häufigsten mutierte Gen in menschlichen Tumoren. Mutationen des Tumorsuppressors p53 finden sich in fast allen Tumorentitäten, durchschnittlich in 50 % aller Patienten. Der Großteil der Mutationen sind einzelne Missense Mutationen, welche in der DNA-Bindungsdomäne liegen und zur Ausbildung eines mutierten Proteins ganzer Länge führen. Neben einem Funktionsverlust (LOF) oder der Behinderung des verbleibenden Wildtyp-Allels, bekannt als dominant-negativer Effekt (DN), kann eine Mutation auch zu einem gain of function (GOF) führen, sodass die Tumorzellen schneller proliferieren, metastasieren oder resistent gegenüber Zytostatika werden. Mechanistisch äußert sich GOF z.B. in metabolischen Veränderungen, auch unter Nährstoffmangel, oder der Inhibition anderer Tumorsuppressoren wie p73. Bisher wurde dies nur für einzelne wenige p53-Mutationen gezeigt, jedoch liegen in Patienten viele verschiedene vor, die sich in ihren Auswirkungen unterscheiden. Ziel dieser Arbeit war es, diverse Mutationen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die proliferative Fitness von Tumorzellen unter Nähstoffmangelzuständen wie Glukose- oder Glutaminentzug sowie einer möglichen Inhibition von p73 zu untersuchen. Verwendet wurde die humane Kolonkarzinomzelllinie HCT116, welche mittels CRISPR/Cas9 derart modifiziert wurde, dass eine Library aller möglichen Mutationen am Hotspot Codon 175 durch Rekombination eingesetzt werden konnte. Nach einer medikamentösen Behandlung oder einem Nährstoffentzug erfolgte die Extraktion von genomischer DNA, welche mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert wurde, sodass eine Anreicherung oder Depletion von Zellen mit bestimmten Mutationen aufgezeigt werden konnte. Diese Depletion oder Anreicherung führte zur Charakterisierung von p53-Mutationen als WT-like, LOF oder pLOF, jedoch wurde für keine der TP53R175-Mutationen ein GOF nachgewiesen. Zur Analyse des GOF-Effekts in Bezug auf die Inhibition von p73 wurden die Isoformen TAp73α oder TAp73β Doxycyclin-induzierbar überexprimiert. Hier konnte für keine der TP53R175-Mutationen ein GOF hinsichtlich einer Inhibition von p73 nachgewiesen werden. Diese Arbeit bestätigt die unterschiedlichen Auswirkungen verschiedener Aminosäurenänderungen im p53-Protein bezüglich der Überlebensfähigkeit in Nähstoffmangelzuständen.
DOI:10.17192/z2023.0616