Charakterisierung und Validierung einer neuartigen makrophagenspezifischen TRAP-Mauslinie (MacTRAP) für die Analyse von Translatomsignaturen renaler Makrophagen

Gewebsmakrophagen spielen eine entscheidende Rolle in der Organ-Homöostase, der Immunität und der Pathogenese verschiedener durch inflammatorische Prozesse angetriebener Erkrankungen. Eine besondere Herausforderung ist dabei die selektive Untersuchung residenter Makrophagen in hoch heterogenen Organ...

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Main Author: Thomaßen, Maximilian Claudius
Contributors: Grgic, Ivica (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2023
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Gewebsmakrophagen spielen eine entscheidende Rolle in der Organ-Homöostase, der Immunität und der Pathogenese verschiedener durch inflammatorische Prozesse angetriebener Erkrankungen. Eine besondere Herausforderung ist dabei die selektive Untersuchung residenter Makrophagen in hoch heterogenen Organen wie der Niere. Um dieses Problem zu adressieren, wurde kürzlich der Ansatz der TRAP (Translational Ribosome Affinity Purification) etabliert und eine neuartige makrophagenspezifische TRAP-Mauslinie generiert. Bei diesen transgenen Mäusen (c-fms-eGFP-L10a, MacTRAP) wird ein eGFP-markiertes ribosomales Protein (L10a) unter der Kontrolle des makrophagenspezifischen Promotors c-fms exprimiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine wissenschaftliche Charakterisierung und umfangreiche Validierung dieser neu geschaffenen TRAP-Mauslinie unter Verwendung biometrischer, molekularbiologischer, biochemischer und immunhistologischer Methoden. Zunächst zeigte sich, dass keine groben Auffälligkeiten in der Entwicklung, dem Verhalten und der Fortpflanzung von MacTRAP vorlagen. Im nächsten Schritt wurde die Transgenexpression untersucht und konnte mittels RT- PCR und Western Blot im Nierengewebe erfolgreich nachgewiesen werden. Immunhistologische Analysen von Nierenschnitten aus MacTRAP-Mäusen konnten eGFP- L10a exprimierende Zellen im tubulointerstitiellen Kompartiment identifizieren, welche ebenfalls positiv für den Makrophagen-Oberflächenmarker F4/80 waren. Im Gegensatz dazu wurde keine signifikante Kofärbung mit klassischen Markern anderer im Tubulointerstitium lokalisierter Zellen wie CD31 (Endothelzellen), PDGFRβ (Perizyten, perivaskuläre Fibroblasten), αSMA (Myofibroblasten, VSMC) oder CD3 (Lymphozyten) festgestellt. Proinflammatorische und gleichzeitig fibroseinduzierende Stimulation durch unilaterale ureterale Obstruktion (UUO-Manöver) führte zu einer signifikanten eGFP- L10a-Hochregulation in fibrotischen UUO-Nieren, welches auf eine adäquate Responsivität des Modells in vivo hinweist und so die Nutzbarkeit einer potenziellen Anwendung von MacTRAP in experimentellen Pathomodellen untermauert und rechtfertigen würde. Aufbauend auf diesen vielversprechenden Validierungsergebnissen soll MacTRAP in Folgeprojekten für die Extraktion von makrophagenspezifischer polysomaler mRNA aus Nierengewebe und nachgeschalteter RNA-Sequenzierung mit bioinformatischer Analytik genutzt werden. Dieser innovative Ansatz soll dazu beitragen, die bisher unzureichend verstandenen in vivo Genexpressionsdynamiken und Signalwegssignaturen residenter renaler Makrophagen umfassend zu definieren. Zusammenfassend liefert diese neue Mauslinie ein neues Werkzeug zum besseren Verständnis der renalen Makrophagenbiologie während Homöostase sowie in verschiedenen entzündungsgetriebenen Krankheitsmodellen der Niere einschließlich der Nierenfibrose. Vor dem Hintergrund der universellen Anwendbarkeit von MacTRAP sind darüber hinaus auch Applikationen für die Untersuchung von Gewebsmakrophagen in anderen Organen in einer Reihe weiterer Pathomodelle in der Zukunft denkbar.
DOI:10.17192/z2023.0425