Investigation on the biosynthesis of polyketide products in Aspergillus ustus and cyclodipeptide derivatives in Streptomyces strains
Natural products have high structural diversity with various pharmacological or biological activities, which are of great significance to our life and drug research. Millions of natural products with versatile structural diversity have been found in nature. In recent years, a large number of microbi...
Main Author: | |
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Contributors: | |
Format: | Doctoral Thesis |
Language: | English |
Published: |
Philipps-Universität Marburg
2023
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Subjects: | |
Online Access: | PDF Full Text |
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Naturstoffe haben eine hohe strukturelle Vielfalt mit verschiedenen pharmakologischen und biologischen Aktivitäten, die für unsere Lebens- und Arzneimittelforschung von großer Bedeutung sind. Millionen von Naturstoffen mit vielseitiger Strukturvielfalt wurden in der Natur gefunden. In den letzten Jahren wurde eine große Anzahl mikrobieller Genomsequenzen in öffentlichen Datenbanken publiziert, welches viele stille oder kryptische Gencluster von Sekundärmetaboliten enthüllte, die in den Genomen der Mikroorganismen verborgen sind. Dies verdeutlicht das große Potenzial zur Entdeckung neuer Stoffwechselprodukte. Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie und der bioinformatischen Analyse bieten auch große Vorteile für die Untersuchung der Biosynthese und der strukturellen Vielfalt dieser Metaboliten. Die strukturelle Differenzierung von Naturstoffen beginnt mit der Bildung von Grundgerüsten unter Verwendung von Grundbausteinen aus dem Primärstoffwechsel, die durch verschiedene Rückgratenzyme katalysiert werden. Die strukturelle Komplexität von Naturstoffen entsteht hauptsächlich durch sogenannte Tailoring Enzyme, welche die Grundgerüste durch eine Reihe chemischer Umwandlungen hochgradig funktionalisieren. Die am besten untersuchten Modifikationsenzyme reichen von verschiedenen Arten von Oxidoreduktasen, Cytochrom P450 Enzymen, bis hin zu verschiedenen Prenyltransferasen (PTs) und Methyltransferasen (MTs). Darüber hinaus tragen auch die nicht enzymatische Ereignisse zu der großen Vielfalt und Komplexität der Endprodukte bei. Die Erforschung unbekannter Gencluster und die Nutzung der Substratpromiskuität von enzymatischen und nichtenzymatischen Reaktionen für die Naturstoff-Biosynthese sind somit ein vielversprechender Weg und eine neue Strategie zur Erforschung der Naturstoffvielfalt. In einer Kooperationsstudie mit Dr. Liujuan Zheng wurde die Biosynthese eines aus Aspergillus ustus isolierten hoch oxygenierten Phenethylderivates Ustethylin A aufgeklärt. Hierbei wurden Probleme bei der Isolierung und Strukturaufklärung instabiler Verbindungen mittels Acetylierung überwunden. Gendeletion und heterologe Expression bewiesen, dass die Phenethyl-Grundstruktur von einer Polyketid-Synthase (UttA) zusammengesetzt wird, welche eine Methyltransferase-Domäne besitzt. Isotopenmarkierungsexperimente bewiesen, dass das Rückgrat von Ustethylin A von Malonyl-CoA, die Methylgruppe im Phenethylrest und die O-Methylgruppe aus L-Methionin abgeleitet sind. Modifikationen an der Grundstruktur durch eine Arylsäurereduktase (UttJ), eine mutmaßliche Nichthäm-FeII/2-Oxoglutarat-abhängige Oxygenase (UttH), ein Cytochrom-P450-Enzym (UttC) und eine O-Methyltransferase (UttF) führen zum Endprodukt Ustethylin A. Diese Studie ist der erste Bericht über den Biosyntheseweg eines phenethyl-haltigen Naturstoffs. In Zusammenarbeit mit Dr. Jing Liu wurde die Biosynthese von Streptoazin C und Guanitrypmycin D1 aufgeklärt. Zunächst wurde durch Genome Mining in Streptomyces aurantiacus ein Cluster mit drei Genen identifiziert, das für eine Cyclodipeptid-Synthase, eine Prenyltransferase und eine Methyltransferase kodiert. Heterologe Expressions- und Zufütterungsexperimente dienten der Aufklärung der Biosyntheseschritte von Streptoazin C. In-vivo-Biotransformationsexperimente bewiesen die hohe Flexibilität der Prenyltransferase SasB gegenüber Tryptophan-haltiger Cyclodipeptide und deren Dehydroderivate für die reguläre C-3-Prenylierung. Diese Studie beschreibt ein Enzym mit einer hohen Substratpromiskuität aus der wenig erforschten Gruppe der Prenyltransferasen in Stoffwechselwegen mit Cyclodipeptid-Synthasen. Anschließend wurde in Streptomyces sp. NRRL S-1521 durch phylogenetische Analysen, heterologe Expression und Strukturaufklärung bewiesen, dass das Cytochrom P450 Enzym GutD1521 den regiospezifischen Transfer von Guanin auf C-2 des Indolrings von cyclo-(L-Trp-L-Tyr) über eine C-C-Verknüpfung katalysiert, welches eine neue chemische Umwandlung innerhalb dieser Enzymklasse repräsentiert. Zufütterungsexperimente zeigten, dass GutD1521 auch weitere tryptophanhaltige Cyclodipeptide und Derivate davon effizient für eine regiospezifische Kopplung mit Guanin akzeptiert, wodurch verschiedene Guanitrypmycin-Analoga erzeugt wurden. Diese Studie beschreibt einen Biokatalysator für ein neues Bindungsmuster zwischen einem Indolring und einer Guanineinheit und erweitert das funktionelle Spektrum von Cytochrom P450 Oxidasen als Tailoring Enzyme.