Wolframabhängige Aldehydoxidoreduktase - Neue Einblicke in Katalyse, Struktur und Kofaktor-Maturation
Die Aldehydoxidoreduktase aus Aromatoleum aromaticum ist eine bakterielle AOR, die aus drei Untereinheiten in der Zusammensetzung α2β2γ besteht und die Oxidation verschiedener Aldehyde zu den entsprechenden Carbonsäuren katalysiert. Die β-Untereinheit enthält dabei einen Wolfram-bis-Pterin-Kofakt...
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2022
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Die Aldehydoxidoreduktase aus Aromatoleum aromaticum ist eine bakterielle AOR, die aus
drei Untereinheiten in der Zusammensetzung α2β2γ besteht und die Oxidation verschiedener
Aldehyde zu den entsprechenden Carbonsäuren katalysiert. Die β-Untereinheit enthält
dabei einen Wolfram-bis-Pterin-Kofaktor (WCo) im aktiven Zentrum. Über ein [4Fe-4S]-
Cluster in der β-Untereinheit und vier weitere [4Fe-4S]-Cluster in der α-Untereinheit können
die Elektronen auf ein FAD in der γ-Einheit übertragen werden. In vitro kann die
Aktivität sowohl mit Benzylviologen als auch mit NAD+ gemessen werden, als physiologischer
Elektronenakzeptor kommt daher neben NAD+ mutmaßlich auch Ferredoxin in
Frage. Unter Verwendung passender Reduktionsmittel wie Ti(III) oder Eu(II) kann auch
die Reduktion von Carbonsäuren zu den entsprechenden Aldehyden beobachtet werden.
Das Enzym besitzt außerdem eine Hydrogenaseaktivität, die elementaren Wasserstoff zur
Reduktion von Benzylviologen, NAD+ oder Carbonsäuren nutzt. Das aor-Operon enthält
neben den drei Strukturgenen aorA-C außerdem zwei weitere Gene aorD und aorE, die für
putative Maturationsfaktoren kodieren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde basierend auf Aromatoleum evansii KB740 ein Expressionssystem
für die AOR erstellt, das es ermöglicht, das Enzym rekombinant zu produzieren
und mittels Affinitätschromatographie aufzureinigen. Dabei wurden die Bedingungen so
weit optimiert, dass die Aktivität der rekombinanten AOR die des nativ gereinigten Enzyms
deutlich übersteigt. Neben der Aktivität wurden außerdem unter anderem der Gehalt
an Wolfram und Eisen sowie FAD bestimmt. Außerdem wurden Experimente zur Hydrogenaseaktivität
des Enzyms durchgeführt.
Neben dem Enzym selbst und potentiellen biotechnologischen Anwendungen ist auch
der Wolframkofaktor und dessen Maturation von besonderem Interesse. In weiten Teilen
entspricht die Biosynthese des WCo der des Molybdän-Kofaktors (MoCo). Trotz der
chemischen Ähnlichkeit von Wolframat und Molybdat erfolgt der Einbau des WCo in die
AOR dennoch sehr spezifisch. Als möglicher Ansatzpunkt für diese Diskriminierung von
Molybdän und Wolfram wurden in der Literatur die beiden Paraloge der Molybdopterin-
Molybdotransferase MoeA1 und MoeA2 diskutiert.
Um die Rolle dieser beiden Proteine in vivo zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit
ΔmoeA-Deletionsmutanten von A. evansii generiert. Mithilfe dieser Stämme konnte gezeigt
werden, dass MoeA2 für die Synthese des WCo zwingend notwendig ist, die Synthese
des MoCo hingegen mit beiden MoeA-Paralogen abläuft. Zusammen mit der Beobachtung,
dass die beiden Maturationsfaktoren AorD und/oder AorE ebenfalls eine wichtige Rolle
für die Aktivität der AOR spielen, lässt sich ein Mechanismus für die Maturation des WCo
postulieren, mit dem sich der selektive Einbau von Wolfram erklären lässt. |
|---|---|
| Physical Description: | 79 Pages |
| DOI: | 10.17192/z2023.0222 |