Elucidation of novel biosynthetic pathways for the discovery of cyclodipeptide derivatives from Streptomyces species

Cyclodipeptide (CDPs) mit einem 2,5-Diketopiperazin (DKP) Grundgerüst sind weit verbreitet in unterschiedlichen Lebensformen, von einfachen Bakterien und Pilzen, bis hin zu komplexeren Arten, wie Pflanzen und Tieren. Sie besitzen vielfältige biologische und pharmakologische Effekte, zum Beispiel antibiotische, antifungale und antiproliferative Wirkungen. In Mikroorganismen werden CDPs von zwei verschiedenen Enzymfamilien gebildet, entweder von nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPSs), die vor allem in Pilzen vorkommen, oder von Cyclodipeptidsynthasen (CDPSs), die sich hauptsächlich in Bakterien finden lassen. NRPSs, welche CDPs herstellen, sind vergleichsweise große (~2500 Aminosäuren), bi-modulare Enzyme, die freie Aminosäuren als Substrate nutzen. CDPSs sind hingegen kleiner (200 – 300 Aminosäuren) und benötigen bereits aktivierte Aminoacyl-tRNAs zur Knüpfung von Peptidbindungen. Die Bildung des DKP-Rings führt zu einer erhöhten Stabilität der CDPs gegen Proteolyse im Vergleich zu ihren nicht cyclischen Verwandten. Dies ermöglicht eine Vielzahl faszinierender Reaktionen, die von modifizierenden Enzymen katalysiert werden. Deren genetische Information befindet sich meistens in direkter Nachbarschaft zu der von Rückgrat-Enzymen, wie CDPSs. Daher spricht man von biosynthetischen Genclustern (BGCs). In CDPS-abhängigen Biosynthesewegen umfassen solche modifizierenden Enzyme Cyclodipeptidoxidasen (CDOs), Cytochrom P450 (P450) Enzyme, FeII/2-Oxoglutarat abhängige (FeII/2-OG) Oxidasen, sowie Methyl- (MTs) und Prenyltransferasen (PTs). In dieser Doktorarbeit wurden acht solcher BGCs durch genomgestützte Analysen entdeckt und deren Funktionen mittels heterologer Expression und biochemischen Untersuchungen entschlüsselt. Im ersten Projekt wurde ein BGC aus Streptomyces cinnamoneus zur detaillierten Untersuchung ausgewählt und gtm Gencluster benannt. Es besteht aus fünf Genen, die für vier Enzyme codieren – eine CDPS (GtmA), eine CDO (GtmBC), ein P450 Enzym (GtmD) und eine FeII/2-OG Oxidase (GtmE). Die Gene wurden in verschiedenen Kombinationen in den replikativen Vektor pPWW50A kloniert und in Streptomyces albus J1074 (S. albus) heterolog exprimiert. Mittels LC-MS und NMR Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass GtmA cyclo-L-Trp-L-Met synthetisiert, GtmBC eine Doppelbindung am DKP auf Seite des Methioninrests einfügt, GtmD ein Guanin auf den Tryptophanrest überträgt und GtmE eine zweite Doppelbindung auf der gegenüberliegenden Seite des DKP bildet. Zusammen führt diese Kaskade zur Entstehung des neuen Sekundärmetaboliten Guatrypmethine C. Die Bildung der zweiten Doppelbindung stellt eine neuartige Reaktion für FeII/2-OG Oxidasen in CDPS abhängigen Biosynthesewegen dar. Daher wurde diese Reaktion biochemisch genauer untersucht, indem Enzymassays mit rekombinantem Protein durchgeführt wurden. So konnte bestätigt werden, dass GtmE tatsächlich die Umsetzung des Vorläufers Guatrypmethine A zu dem Endprodukt Guatrypmethine C katalysiert. Für das stabile Isomer Guatrypmethine B wurde hingegen nur eine sehr geringe Umsetzung beobachtet. Diese experimentelle Beobachtung konnte durch quantenchemische Berechnung mittels Dichtefunktionaltheorie gestützt werden. In Kooperation mit Dr. Jing Liu, konnte im zweiten Teil der Arbeit ein weit verbreiteter Genlokus mit den beiden Genen gymAB in 47 verschiedenen Aktinobakterien identifiziert werden. GymA kodiert für eine CDPS und gymB für ein P450 Enzym. Letzteres ist eng mit CYP121, einem überlebenswichtigen Enzym aus Mycobacterium tuberculosis, verwandt. Sechs Streptomyces Arten wurden als Kandidaten zur Aufklärung dieser BGCs ausgesucht. Analog zum ersten Projekt wurden ihre Gene in pPWW50A kloniert und in S. albus überexprimiert. Die Untersuchung der Extrakte mittels LC-MS in Kombination mit NMR Analysen der aufgereinigten Produkte ergab, dass alle sechs CDPSs cyclo-L-Tyr-L-Tyr (cYY) als Hauptprodukt bilden. Die P450 Oxidasen katalysieren im Anschluss zwei verschiedenartige Reaktionen – entweder die Knüpfung einer intramolekularen Bindung innerhalb von cYY, wobei Mycocyclosin entsteht, oder den intermolekularen Transfer der Nukleinbasen Guanin bzw. Hypoxanthin, der zur Bildung der neuentdeckten Sekundärmetabolite Guatyromycine A bzw. B führt. Die GymB katalysierten Reaktionen wurden des Weiteren durch biochemische Untersuchungen mit rekombinant hergestellten Proteinen aller sechs Kandidaten bestätigt. Die gleiche intramolekulare Bindung knüpft auch CYP121 aus Mycobacterium tuberculosis, daher wurde das entsprechende Gencluster in gleicher Weise exprimiert. CYP121 bildet hingegen ausschließlich Mycocyclosin, was dafürspricht, dass die GymBs womöglich aus CYP121 hervorgegangen sind und sich im Laufe der Evolution leicht verändert haben. Im dritten Projekt war ich an der Aufklärung eines BGC aus Streptomyces aurantiacus beteiligt. Das BGC kodiert für die CDPS SasA, die PT SasB und die MT SasC. Wir konnten beweisen, dass das sasABC Gencluster für die Bildung von Streptoazine C verantwortlich ist. Die daran beteiligte PT SasB prenyliert in regulärer Weise beide Tryptophanreste in cyclo-L-Trp-L-Trp. Durch Inkubation mit anderen CDPs und dehydrogenierten Derivaten konnte gezeigt werden, dass SasB eine breite Substratspezifität besitzt und mindestens acht zusätzliche CDP-Derivate effizient umsetzten kann.