In vitro Realisation of the Hydroxypropionyl-CoA/Acrylyl-CoA Cycle

The birth of the industrial revolution initiated a significant shift in the global carbon cycle. In the intervening centuries, the production of anthropogenic atmospheric carbon rose dramatically and has resulted in a pronounced climactic shift. The rate of this change is accelerating, largely irrev...

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Main Author: McLean, Richard
Contributors: Erb, Tobias (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2022
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Mit dem Beginn der industriellen Revolution hat sich der globale Kohlenstoffkreislauf erheblich verändert. In den dazwischen liegenden Jahrhunderten stieg die Produktion von anthropogenem atmosphärischem Kohlenstoff dramatisch an und hat zu einer ausgeprägten klimatischen Veränderung geführt. Dieser Wandel beschleunigt sich, ist kurzfristig weitgehend unumkehrbar und wird voraussichtlich tiefgreifende negative Auswirkungen auf nahezu alle Aspekte des menschlichen Lebens haben, von der Kultur über die Wirtschaft bis hin zur geistigen und körperlichen Gesundheit. Es ist inzwischen allgemein anerkannt, dass die bisherigen Praktiken nicht nachhaltig sind und dass wir unverzüglich Maßnahmen ergreifen müssen, wenn wir dieses Problem verringern wollen. Es wurden weltweite Anstrengungen zur Verringerung der Kohlenstoffemissionen unternommen, und es werden derzeit viele neue Technologien entwickelt, um die Produktion effizienter zu gestalten und Kohlenstoff aktiv aus der Atmosphäre zu entfernen. Trotz dieser Bemühungen ist die durchschnittliche CO2-Konzentration in der Atmosphäre weiter angestiegen, und das Klima hat sich weiter verändert. Wenn wir den globalen atmosphärischen Kohlenstoffgehalt erfolgreich reduzieren wollen, ist eine Vielzahl verschiedener Methoden erforderlich. Ein interessanter Ansatz ist die Entwicklung von Designerorganismen, die CO2 binden können. Die natürliche Kohlenstoffbindung ist der Eckpfeiler des organischen Lebens, aber es gibt potenzielle Verbesserungen, die vorgenommen werden könnten, um effizientere kohlenstoffbindende Organismen zu erzeugen. Neben der Beseitigung von atmosphärischem CO2 kann der Kohlenstoff potenziell in eine beliebige Anzahl von Produkten mit Mehrwert umgewandelt werden. In dieser Arbeit haben wir den künstlichen Hydroxypropionyl-CoA/Acrylyl-CoA-Zyklus in einem In-vitro-System untersucht. Wir wollen zeigen, dass der Zyklus bei Umgebungstemperatur und in Gegenwart von Sauerstoff funktioniert, was ihn zu einem attraktiven Kandidaten für künftige In-vivo-Entwicklungen macht. Im ersten Teil untersuchen wir den oxidativen Teil des Zyklus, der die Umwandlung von (2S)-Methylmalonyl-CoA in Malonyl-CoA beinhaltet. Ursprünglich geschah dies analog zum TCA-Zyklus, doch aufgrund von Schwierigkeiten mit mehreren Schritten dieses Weges haben wir einen neuartigen Bypass eingeführt, der Succinyl-CoA direkt zu dem metabolisch ungewöhnlichen Fumaryl-CoA oxidiert. Dieser Teil des Zyklus umfasst auch die erste kohlenstoffbindende Reaktion, die ATP-abhängige Carboxylierung von Acetyl-CoA. Im zweiten Teil bewerten wir den reduktiven Teil des Zyklus, der die Rückumwandlung von Malonyl-CoA in (2S)-Methylmalonyl-CoA beinhaltet. Dieser Teil umfasst drei Reduktionsreaktionen, und wir haben zwei mögliche Wege untersucht, die entweder über 3-Hydroxypropionyl-CoA oder β-Alanyl-CoA verlaufen. Beide Varianten sind zwar funktionell, aber das Fehlen von β-Alanin-spezifischen Enzymen, insbesondere einer β-Alanyl-CoA-Synthetase, machte den 3-Hydroxypropionyl-CoA-Weg praktischer. In jedem Fall endet dieser Abschnitt mit der reduktiven Carboxylierung von Acrylyl-CoA zu (2S)-Methylmalonyl-CoA. Schließlich wurden diese Wege kombiniert, um einen kontinuierlichen Zyklus zu erhalten. Nachdem der Fluss durch den Zyklus erreicht war, versuchten wir, eine Reihe von daraus resultierenden Problemen zu lösen, darunter die Regeneration von ATP und NADPH, die Beseitigung reaktiver Sauerstoffspezies, den Schutz vor der radikalen Inaktivierung von Coenzym B12, die Regeneration von FAD-abhängigen Enzymen und die Reparatur chemisch veränderter Cofaktoren. Der aktuelle HOPAC-Zyklus produziert ~500 µM Glykolat oder fünf CO2-Äquivalente pro Acetyl-CoA-Molekül. Insgesamt haben wir in dieser Arbeit den HOPAC-Zyklus, einen in der Natur neuartigen synthetischen CO2-Fixierungsweg, in vitro etabliert und seine Funktionsweise weiter optimiert. Damit haben wir einen weiteren Grundsatzbeweis für die synthetische CO2-Fixierung erbracht und den Weg für die künftige Implementierung von HOPAC in natürlichen und synthetischen Zellen geebnet.