Molecular mechanisms of mitochondrial de novo [2Fe-2S] cluster formation and lipoyl biosynthesis

Eisen-Schwefel (Fe/S)-Cluster sind kleine anorganische Protein-Cofaktoren, die in fast allen bekannten Organismen vorkommen. Sie ermöglichen verschiedene Proteinfunkti-onen wie Elektronentransfer und Katalyse und werden für zahlreiche essentielle biologi-sche Prozesse wie Zellatmung, Translation sowie DNA-Synthese und -Reparatur benö-tigt. Fe/S-Cluster weisen zumeist einfache Strukturen auf, wobei der rhombische [2Fe-2S]- und der kubische [4Fe-4S]-Typ am häufigsten sind. Für ihre Biosynthese und den Einbau in Zielproteine sind jedoch komplexe Proteinmaschinerien erforderlich. Die mi-tochondriale Fe/S-Protein-Biogenese erfordert bis zu 18 verschiedene Proteine der Fe/S-Cluster-Assemblierungs (ISC)-Maschinerie. Die frühe ISC-Maschinerie assemb-liert [2Fe-2S]-Cluster de novo, welche von der späten ISC-Maschinerie zu [4Fe-4S]-Clustern fusioniert und in Zielproteine eingebaut werden. Obwohl die Funktionen vieler Proteine der ISC-Maschinerie eingehend charakterisiert wurden, sind die molekularen Mechanismen der mitochondrialen Fe/S-Protein-Biogenese und insbesondere der de novo Clustersynthese nicht vollständig verstanden. Im ersten der beiden Projekte dieser Arbeit sollte die Assemblierung von Fe und S auf dem Gerüstprotein ISCU2 bei der [2Fe-2S]-Clustersynthese untersucht werden. Hierbei werden ein Fe-Ion und ein Persulfidrest auf das ISCU2-Assemblierungszentrum über-tragen, welches fünf konservierte Aminosäuren mit vermutlich funktionaler Bedeutung aufweist (Cys69, Asp71, Cys95, His137 und Cys138). Effiziente Persulfurierung von einem der drei konservierten ISCU2-Cysteine durch den heterodimeren Cystein-Desulfurasekomplex NFS1-ISD11-ACP ((NIA)2) setzt die Bindung von ISCU2 (U) und FXN (X) voraus, wobei (NIAUX)2 entsteht. Das Persulfid wird durch Elektronentransfer vom Ferredoxin FDX2 zu Sulfid reduziert. Schließlich führt die Dimerisierung von zwei [1Fe-1S]-ISCU2-Einheiten zur Bildung eines [2Fe-2S]-Clusters. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NFS1 mit hoher Spezifität und Effizienz ISCU2 Cys138 persulfuriert, wo-bei kein intermediärer Schwefeltransfer über andere ISCU2-Cysteinreste beobachtet wurde. Die physiologisch relevante Persulfurierung erforderte voriges Binden eines Fe(II)-Ions an ISCU2. Weiterhin wurden die ISCU2-Reste Cys69, Cys95, Cys138 und wahrscheinlich Asp71 als Liganden des maturierten [2Fe-2S]-Clusters identifiziert. Die Kombination struktureller, spektroskopischer und biochemischer Analysen erlaubte die Bestimmung der bisher weitestgehend unbekannten Fe-Koordination durch ISCU2 in aufeinanderfolgenden Zwischenschritten der [2Fe-2S]-Clustersynthese. Fe(II) wurde von freiem ISCU2 tetraedrisch koordiniert (über Cys69, Asp71, Cys95 und His137), während die ISCU2 Bindung an (NIA)2 ein Gleichgewicht zwischen einer favorisierten tetraedrischen und einer oktaedrischen Koordination (über Asp71, Cys95, Cys138 und Wasserliganden) hervorrief. Bindung von FXN an (Fe-NIAU)2 verschob das Gleichge-wicht in Richtung der oktaedrischen Spezies. Es wurden spezifische intermolekulare Wechselwirkungen zwischen FXN und ISCU2 identifiziert, die die Bildung der oktaedri-schen Spezies unterstützen und eine effiziente [2Fe-2S]-Clustersynthese ermöglichen. Darüber hinaus wurde die Struktur von (Fe-NIAUX)2 mit persulfuriertem ISCU2 Cys138 durch Elektronenkryomikroskopie mit einer Auflösung von 2.4 Å bestimmt, die erste Struktur eines (NIAUX)2 Komplexes mit einer Auflösung unter 3 Å. Der Cys138-Persulfidrest war an einer oktaedrischen Fe-Koordination ähnlich der von nicht persulfu-rierten Komplexen beteiligt. Zusammengenommen ermöglichten die Studien die Be-schreibung eines detaillierten molekularen Mechanismus der physiologischen ISCU2-Persulfurierung. Das zweite Projekt dieser Arbeit befasste sich mit der Funktion humaner Lipoylsynthase (LIAS), einem mitochondrialen [4Fe-4S]-Enzym. Lipoyl ist Cofaktor von α-Ketosäure-Dehydrogenasen sowie des Glycin-spaltenden Systems und somit essentiell für den mitochondrialen Kohlenstoffmetabolismus. LIAS besitzt zwei [4Fe-4S]-Cluster, einen katalytischen und einen Hilfscluster. Der katalytische Cluster leitet durch Elektronen-transfer eine Radikalreaktion ein, bei der zwei Schwefelatome aus dem Hilfscluster in ein Octanoylsubstrat inkorporiert werden. In dieser Arbeit sollte der unbekannte physio-logische Elektronendonor des katalytischen Clusters humaner LIAS identifiziert werden. Dafür wurde ein in vitro Assay entwickelt, der die humane Lipoylsynthese nachstellt. Nur FDX1 und nicht das strukturell ähnliche FDX2 fungierte als effizienter Elektronen-donor für die LIAS-Katalyse in vitro, in Übereinstimmung mit AlphaFold-basierten in silico Analysen von LIAS-FDX-Interaktionen. Die in vitro Lipoylsynthese war mit FDX1 sogar deutlich effizienter als mit dem üblicherweise verwendeten artifiziellen Redukti-onsmittel Dithionit. Die hohe FDX1-Spezifität bei der Lipoylsynthese wurde auf den C-terminus zurückgeführt, da das Entfernen des konservierten C-Terminus von FDX2 dessen geringe Funktion in vitro erheblich verbesserte. Weiterhin wurde die Wirkung des Antikanzerogens und Kupferionophors Elesclomol (Ele) auf die Lipoylsynthese in vitro untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl Cu als auch der Ele:Cu-Komplex, aber nicht Ele allein, die Lipoylsynthese hemmen, wodurch ein wesentliches Ziel der Ele-Toxizität identifiziert wurde. Zusammenfassend ermöglichte diese Arbeit die strukturelle Bestimmung der kooperati-ven Funktion von fünf ISCU2-Resten, die von essentieller Bedeutung für aufeinander-folgende Stadien der de novo [2Fe-2S]-Clustersynthese sind, und bietet dadurch wert-volle Einblicke in die molekulare Dynamik dieses Prozesses. Darüber hinaus trägt die Arbeit zu einem besseren Verständnis der humanen Lipoylsynthese und der unter-schiedlichen Funktionen der beiden menschlichen Ferredoxine bei. FDX1 wurde als physiologischer Elektronendonor für die LIAS-Katalyse identifiziert, zusätzlich zu seiner seit langem bekannten Rolle in der Steroidsynthese.