Zwischen Zellzyklus-Arrest und Apoptose – p53-Kooperativitätsmutanten in vivo

Das p53-Protein übt seine Eigenschaften als Tumorsuppressor aus, indem es über das Schicksal einer Zelle bestimmt. Die Integration intrinsischer und extrinsischer zellulärer Stresssignale erlaubt p53 als tetramerem, sequenz-spezifischem Transkriptionsfaktor entscheidende Zielgene zu regulieren, die...

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Main Author: Schäfer, Jonas Aaron
Contributors: Stiewe, Thorsten (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2022
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Description
Summary:Das p53-Protein übt seine Eigenschaften als Tumorsuppressor aus, indem es über das Schicksal einer Zelle bestimmt. Die Integration intrinsischer und extrinsischer zellulärer Stresssignale erlaubt p53 als tetramerem, sequenz-spezifischem Transkriptionsfaktor entscheidende Zielgene zu regulieren, die entweder einen Zellzyklusarrest, Seneszenz oder Apoptose befördern. Wie diese differentielle Expression reguliert wird, ist nach wie vor Gegenstand in-tensiver Forschung. Unlängst wurde in der Arbeitsgruppe Stiewe gezeigt, dass eine intrinsische Eigenschaft von p53 – die kooperative DNA-Bindung – die-sen Prozess moduliert. Durch Mutagenese zweier geladener Aminosäurereste der H1-Helix (E180 und R181), die über ionische Wechselwirkungen eine Stabilisierung zwischen je zwei p53-Monomeren im Tetramer vermitteln, konn-ten Mutanten mit unterschiedlich ausgeprägter DNA-Bindungskooperativität generiert werden. Während p53-Mutanten mit verminderter Kooperativität wei-terhin einen Zellzyklusarrest induzieren können, so sind sie in der Apoptos-einduktion defizient. Mutationen mit erhöhter Kooperativität zeigen demge-genüber sogar erhöhte Apoptoseraten im Vergleich zu Wildtyp-p53. Ziel dieser Arbeit war es, die Effekte dieser p53-Kooperativitätsmutanten in Bezug auf das Tumorwachstum sowie auf das Ansprechen auf eine chemotherapeutische Behandlung mit Hilfe eines Xenotransplantations-Mausmodells zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde eine p53-defiziente klonogene Reporter-Zelllinie mit Expression einer Luciferase generiert und mit den p53-Mutanten superinfiziert. Nach subcutaner Injektion dieser Zellen in immunkompromittierte Mäuse, konnte die Tumorlast im Zeitverlauf wiederholt an kleinvolumigen Blutproben durch Aktivitätsmessung der sezernierten Gaussia-Luciferase gemessen werden. Die methodischen Aspekte dieser Ar-beit betreffend konnte gezeigt werden, dass i) die Reporterzelllinie ein geeig-netes Instrument zur Untersuchung der p53-Antwort ist mit einem zu den pa-rentalen HCT 116-Zellen identischem Verhalten und ii) dass mit Hilfe dieser Reporterzelllinie die Aktivitätsmessungen der Gaussia-Luciferase ein einfa-ches, robustes und vor allem präzises und sensitives Werkzeug zur Quantifi-zierung der Tumorlast darstellen. In der Anwendung dieses Messsystems ergab sich kein nachweisbarer Ein-fluss auf den Spontanverlauf des Tumorwachstums in Abhängigkeit der Ko-operativität. Problem dieser Untersuchung war jedoch ein rascher Abfall der p53-Expression in den Krebszellen, der interessanterweise mit steigender Kooperativität zunehmend ausgeprägt war. Dieser negative Selektionseffekt erlaubt einen indirekten Rückschluss auf die mit der Kooperativität der p53-Mutanten korrelierende Effektstärke (verstärkte Tumorsuppression). Unter chemotherapeutischer Behandlung, die zu einer Stabilisierung von p53 führte, konnte trotz dieses Selektionseffekts ein vermindertes Ansprechen einer Mu-tante mit niedriger Kooperativität gezeigt werden. Genomumspannende Gen-expressionsuntersuchungen an Tumorproben bestätigen für dieses Modell bisherige in vitro gemachte Beobachtungen, nämlich dass eine niedrige Ko-operativität zwar hinreichend zur Induktion von Zellzyklusarrest-Genen ist, zur Apoptose-Induktion jedoch eine höhere Kooperativität erforderlich ist, die mit einem erhöhten Spektrum an transaktivierten Zielgenen einhergeht. In weiteren Arbeiten konnten Kollegen zeigen, dass die Kooperativität von p53 durch Phosphorylierung von Serin 183/185 negativ beeinflusst werden kann. Phosphorylierungen dieser Aminosäuren erfolgen möglicherweise durch die Aurorakinase B. Mehrere Inhibitoren dieser Kinase, die bei zahlreichen Krebserkrankungen überexprimiert ist, befinden sich zum Teil bereits in fort-geschrittener klinischer Erprobung.
Physical Description:120 Pages