New central carbon metabolic pathways in Alphaproteobacteria: from natural to synthetic metabolism

CO2 is one of the main greenhouse gases driving global warming, and plays a fundamental role in the global carbon cycle. The threat posed by climate change needs to be addressed during this century, if its worst effects are to be prevented or at least mitigated. While new (bio)technological solutio...

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Main Author: Severi, Francesca
Contributors: Erb, Tobias (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2022
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CO2 ist eines der wichtigsten Treibhausgase, die die globale Erwärmung verursachen, und spielt eine grundlegende Rolle im globalen Kohlenstoffkreislauf. Die Bedrohung durch den Klimawandel muss noch in diesem Jahrhundert angegangen werden, wenn seine schlimmsten Auswirkungen verhindert oder zumindest gemildert werden sollen. Während neue (bio)technologische Lösungen für die erfolgreiche Bewältigung dieser gewaltigen Herausforderung unerlässlich sind, muss auch das Verständnis der Quellen, Senken und Flüsse des globalen Kohlenstoffkreislaufs ständig verbessert werden, um genaue Modelle zu erstellen und die Auswirkungen menschlicher Eingriffe auf das Klima vorherzusagen. Diese Arbeit zielt darauf ab, zu beiden Ansätzen beizutragen, d. h. das Wissen über den globalen Kohlenstoffkreislauf zu erweitern und biotechnologische Werkzeuge zur Umwandlung von CO2 in Mehrwertprodukte bereitzustellen. Im ersten Teil dieser Arbeit wird der β-Hydroxyaspartat-Zyklus beschrieben, ein Glyoxylat-Assimilationsweg, der ursprünglich vor fast 60 Jahren vorgeschlagen, aber bis heute nicht vollständig aufgeklärt wurde. Der Gencluster, der für den Regulator und die vier Enzyme des Zyklus kodiert, wurde in Paracoccus denitrificans identifiziert, und ihre biochemischen Eigenschaften wurden charakterisiert. Dabei wurde eine seltene primäre Iminreduktase entdeckt, strukturell aufgeklärt und einer neuen Familie innerhalb der Ornithin-Cyclodeaminase/µ-Kristallin-Superfamilie zugeordnet. Zusätzliche phylogenetische Analysen ergaben, dass der β-Hydroxyaspartat-Zyklus unter marinen Alphaproteobakterien weit verbreitet ist, insbesondere in den Ordnungen Rhizobiales und Rhodobacterales, und auch in ozeanischen Metagenomen ubiquitär vorhanden ist, was darauf schließen lässt, dass er in diesem Lebensraum eine wichtige ökologische Rolle spielt. Feldstudien untermauerten diese Hypothese und ergaben, dass der β-HydroxyaspartatZyklus an der Assimilation von Glykolat, einem reichlich vorhandenen Phytoplankton Exudat, durch heterotrophe Meeresbakterien beteiligt ist, wodurch eine neue Dimension des marinen Kohlenstoffkreislaufs aufgedeckt wurde. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Engineering des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels von Methylorubrum extorquens AM1 für die Produktion von wertvollen Stoffen aus Methanol, das nachhaltig aus CO2 und Wasserstoff gewonnen werden kann. Der Ethylmalonyl-CoA-Weg ist essentiell für das Wachstum auf C1- und C2-Stoffe und enthält viele Acyl-CoA-Thioester-Intermediate. Um Zugang zu diesen Intermediaten zu erhalten, wurde das metabolische Netzwerk von M. extorquens AM1 neu verdrahtet. Die heterologe Implementierung des Glyoxylatzyklus, gefolgt von einer adaptiven Laborevolution, führte zu einem Stamm, der in der Lage war, auf Methanol zu wachsen, ohne den nativen Ethylmalonyl-CoA-Weg zu nutzen. Die Charakterisierung des manipulierten und weiterentwickelten Stammes durch Resequenzierung des gesamten Genoms, Proteomik und gezielte Metabolomik ergab, dass zwei Mutationen in der mutmaßlichen Promotorregion und der kodierenden Sequenz der Isocitrat-Dehydrogenase für die allgemeineUmstellung des zellulären Kohlenstoffflusses vom TCA-Zyklus auf den Glyoxylatzyklus verantwortlich waren. Darüber hinaus wurde der Nachweis der prinzipiellen Herstellung von Crotonsäure aus Methanol und Acetat erbracht, und die wichtigsten Engpässe des Prozesses, einschließlich des unerwünschten Flusses in die Polyhydroxybutyratsynthese, wurden ermittelt.