Development of enhanced furin inhibitors with reduced toxicity as potential broad spectrum antiviral drugs

Zu Beginn des 20. Jahrhunderts konzentrierte sich die Peptidforschung weitestgehend auf menschliche Signalhormone. Der erste Durchbruch gelang mit der medizinischen Anwendung des Insulins aus tierischen Bauchspeicheldrüsen, das die Behandlung von Typ-1-Diabetes revolutionierte. Seitdem werden mehr als 80 therapeutisch wirksame Peptide bei unterschiedlichsten Krankheitsbildern wie Diabetes, Krebs, Multiple Sklerose, HIV-Infektion und chronische Schmerzen eingesetzt. Die Synthese therapeutischer Peptide wurde mit der Entwicklung der Festphasenpeptidsynthese durch Merrifield im Jahr 1963 möglich. Dieser Meilenstein ermöglichte den Zugang zu reinen und ausreichenden Mengen an Peptiden und ermöglichte unzählige Forschungsprojekte zur Bestimmung ihrer Funktion und Struktur. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Entwicklung synthetischer Inhibitoren der calciumabhängigen subtilisinartigen Serinprotease Furin, die zur Familie der Proproteinkonvertasen (PCs) gehört. Es wird ubiquitär in Vertebraten und Invertebraten exprimiert und aktiviert zahlreiche Proproteinsubstrate wie Prohormone, Proenzyme und Proformen von Rezeptoren oder extrazellulärer Matrixproteine. Furin ist auch an der Tumorigenese, neurodegenerativen Erkrankungen, Diabetes oder Arteriosklerose beteiligt, sowie an zahlreichen bakteriellen und viralen Erkrankungen. Beispielsweise spaltet es Vorstufen bakterieller Toxine wie Pseudomonas Exotoxin A, Shiga-Toxin und Diphtherietoxin. Einige Viren besitzen Oberflächenproteine, die zur Fusion viraler und Wirtszellmembranen beitragen und durch Furin oder verwandte PCs aktiviert werden. Beispiele sind die Glykoproteine hochpathogener Vogelgrippeviren, von Masern-, Ebola- oder Flaviviren wie Dengue-, West-Nil- und Zika-Viren. Interessanterweise ist Furin auch an der Aktivierung des Spike-Oberflächenproteins des neuen SARS-CoV-2 beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige Furininhibitoren entwickelt, synthetisiert, enzymkinetisch und strukturell charakterisiert, sowie ihre antivirale Wirksamkeit bestimmt. Im ersten Manuskript wurden mehrere Serien makrozyklischer Furininhibitoren synthetisiert. Die Entwicklung zyklischer Peptide ist eine weit verbreitete Strategie zur Verbesserung der Stabilität und Bioverfügbarkeit therapeutischer Peptide. Die Zyklisierung erfolgte zwischen verschiedenen Resten an unterschiedlichen Positionen dieser substratanalogen Inhibitoren mittels verschiedener Linkersegmente. Die inhibitorische Wirksamkeit dieser Verbindungen wurde durch enzymkinetische Untersuchungen mit löslichem humanen Furin bestimmt. In Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern wurde der Bindungsmodus ausgewählter zyklischer Inhibitoren im Komplex mit Furin und ihre antivirale Wirksamkeit in mit dem Respiratorischen Synzytial-Virus (RSV) infizierten Zellen ermittelt. Die zweite Arbeit beschreibt die Optimierung des bereits bekannten linearen Inhibitors MI-1148, der Furin mit einem Ki-Wert von 5 pM hemmt, sich jedoch an Mäusen und Ratten als relativ toxisch erwiesen hat. Zusätzliche Studien mit strukturell verwandten Verbindungen legten nahe, dass die Toxizität dieser Verbindungen durch den stark multibasischen Charakter dieses Verbindungstyps und nicht durch die eigentliche Hemmung der Wirtsprotease Furin verursacht wird. Durch Austausch der Argininreste (pKa der Seitenkette 13.5) durch die nicht-kanonische Aminosäure Canavanin (pKa 7.0) wurde eine neue Serie wirksamer Furinhemmstoffe hergestellt. Die effektivste Verbindung MI-1851 hemmt Furin mit einem Ki-Wert von 10.1 pM. Wie erwartet, hat sich diese Verbindung in Mäusen als deutlich weniger toxisch erwiesen. In Zellkulturstudien zeigten die neuartigen canavaninhaltigen Verbindungen eine signifikante antivirale Aktivität gegen furinabhängige Viren, wie RSV, West-Nil- und Dengue-2-Virus. In einer dritten Arbeit aus dem Arbeitskreis von Prof. Friebertshäuser wurde für den Inhibitor MI-1851 auch eine antivirale Wirkung auf das neue SARS-CoV-2 nachgewiesen. Darüber hinaus konnte durch eine Reihe neu synthetisierter FRET-Substrate, die von der Sequenz der potenziellen S1/S2-Spaltstelle im Spike-Protein verschiedener Coronaviren abgeleitet wurden, die Aktivierung der SARS-CoV-2 Sequenz durch Furin nachgewiesen werden. In einer vierten Arbeit wird die Synthese und Charakterisierung einer kleinen Serie von 11 neuen Fluoreszenzsubstraten beschrieben, die mit den fünf basischen PCs Furin, PC1, PC2, PC5A und PC7 vermessen wurden. Für vier der getesteten PCs (außer PC5A) wurden verbesserte Substrate identifiziert, die effizienter als die bekannten Referenzsubstrate gespalten werden. Die verbesserten Furinsubstrate gestatteten Messungen bei deutlich reduzierten Enzymkonzentrationen, bei denen erstmals ein sogenanntes slow-binding Verhalten für den Inhibitor MI-1148 festgestellt wurde. Unter diesen Bedingungen konnten die individuellen Assoziations- und Dissoziations-Geschwindigkeitskonstanten kon und koff-bestimmt werden. Die neuen Inhibitoren und Substrate können zukünftig helfen, die Rolle des Furins und verwandter PCs bei physiologischen Prozessen und Erkrankungen weiter aufzuklären.