Study on late competence proteins involved in natural transformation of Bacillus subtilis

The following study comprises in vivo and in vitro data on several of the so-called late competence proteins, which are involved in natural transformation of Bacillus subtilis. The gram-positive bacterium B. subtilis belongs to those bacteria, who are able to take up DNA from their environment and i...

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Main Author: Burghard-Schrod, Marie T.
Contributors: Graumann, Peter Ludwig (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2021
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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In der hier vorgelegten Studie wurden sogenannte Kompetenzproteine, die an der natürlichen Transformation von Bacillus subtilis beteiligt sind, untersucht. Das grampositive Bakterium B. subtilis gehört zu einer Vielzahl von Bakterien, die in der Lage sind, DNA aus ihrer Umgebung aufzunehmen und die fremde DNA durch homologe Rekombination in ihr eigenes Chromosom zu integrieren; eine Eigenschaft, die als Kompetenz bezeichnet wird. Diese faszinierende Fähigkeit wird nur von einem Teil der Bakterienkultur ausgeführt, was als Heterogenität bezeichnet wird. Eine bestimmte Anzahl von Zellen exprimiert spezifische Proteine, welche von den späten Kompetenz- Operons kodiert werden. Wenn exogene doppelsträngige DNA aus der Umgebung aufgenommen werden soll, muss diese zunächst die dicke Zellwand von B. subtilis mit einem Durchmesser von ~40 nm passieren. Im Falle von B. subtilis wird diese DNA über eine Pilus-ähnliche Struktur, den sogenannten Pseudopilus in das Periplasma der Zelle transferiert. Die Energie für diesen speziellen Prozess wird wahrscheinlich von der Assemblierungs-/ Disassemblierungs- ATPase ComGA bereitgestellt. Liegt die aufgenommene DNA schließlich im Periplasma vor, wird diese durch den Kompetenzkomplex weiter in das Cytosol der Zelle transportiert. Dabei wird der Komplex aus spezifischen Kompetenzproteinen gebildet, welche sich an der Membran assemblieren. Hierzu gehören ein DNA-bindendes Transmembranprotein (ComEA) und ein Kanalprotein, welches eine hydrophile Pore für die DNA ausbildet (ComEC). In der folgenden Arbeit wurde die unbekannte Rolle des Proteins ComEB im Zusammenhang mit der Kompetenz weiter aufgeklärt und seine enzymatische Funktion in vitro analysiert. Es wurde festgestellt, dass das Protein eine Deaminase-Aktivität besitzt, welche jedoch für die Transformation nicht essentiell ist. Des Weiteren wurde eine Aminosäure von ComEC (D573) als essentiell für die Transformation von B. subtilis identifiziert. Verkürzungen des Proteins ComEC, welches vermutlich eine Exonuklease- Funktion ausübt, wurden heterolog exprimiert und als GST-Tag-Fusionen aufgereinigt. Eine enzymatische Aktivität konnte wahrscheinlich aufgrund von Aggregationen der Proteine nicht nachgewiesen werden. Die intrazelluläre Diffusion von Fluorophore-Fusionen verschiedener Kompetenzproteine, ComEB-mV, ComGA-mV, ComEC-mV und mV-ComEA, wurde mittels Einzelmolekül-Tracking in An- und Abwesenheit von exogener DNA analysiert. Im Falle von ComGA wurde eine C-terminale Fusion mit mVenus, (ComGA-mV) analysiert und es wurde festgestellt, dass das Protein in Anwesenheit von DNA dynamischer wird. Weiterhin wurden erstmals die Lokalisation und Diffusion eines fluoreszenzmarkierten PCR-Produktes innerhalb von kompetenten Bacillus-Zellen analysiert. Hierbei wurde herausgefunden, dass die Diffusion der fluoreszierenden DNA der Diffusion des DNA-bindenden Transmembranproteins mV-ComEA sehr ähnelt. Dies führte zu der Hypothese, dass ComEA als Reservoir für aufgenommene DNA dient, ähnlich wie es bereits für ComEA-Orthologe anderer, natürlich kompetenter Bakterien bekannt ist.