Structural and functional analysis of non-canonical tandem-thioesterases
Nonribosomal peptide synthetases (NRPS) are known to produce a diverse range of bioactive natural products, like antibiotics, immunosuppressants or cytostatics. These pharmacologically important properties have attracted increased scientific interest, on the one hand to advance the discovery of new...
Main Author: | |
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Contributors: | |
Format: | Doctoral Thesis |
Language: | English |
Published: |
Philipps-Universität Marburg
2021
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Subjects: | |
Online Access: | PDF Full Text |
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Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind dafür bekannt eine vielfältige Palette an bioaktiven Naturstoffen zu produzieren, deren Wirkungsbereiche häufig im Einsatz als Antibiotikum, Immunsuppressivum oder Zytostatika sind. Diese pharmakologisch bedeutsamen Eigenschaften haben verstärkt wissenschaftliches Interesse auf sich gezogen, um zum einen die Entdeckung neuer Naturstoffe voran zu treiben. Zum anderen erhofft man sich, über die mechanistische Aufklärung dieser komplexen Synthesestraßen, die katalytischen Eigenschaften für zielgerichtetes Medikamentendesign nutzen zu können. Im Hinblick auf die mechanistische Aufklärung ist die Forschung besonders auf die strukturelle Aufklärung einzelner Domänen und Module angewiesen um für die Funktion essentielle Interaktionen aufzuzeigen, Substratspezifitäten zu erklären und die gezielte Modifikation bestimmter Funktionseinheiten zu erleichtern. Ein besonderes Interesse gilt hier der Funktionsanalyse von Terminationseinheiten, wie der Thioesterase (Te), die für die Produktfreisetzung aus dem NRPS erforderlich ist. Innerhalb der letzten Jahre wuchs das Interesse insbesondere für die Erforschung der ungewöhnlichen Tandem-Te, die bislang überwiegend in NRPS Systemen beschrieben wurde, deren Biosynthese überwiegend makrozyklische Naturprodukte zu vertreten scheint. In dieser Arbeit ist die strukturelle und funktionelle Analyse von ungewöhnlichen Tandem-Te auf Basis des Modellorganismus Xenorhabdus nematophila ATCC 19061 beschrieben. In voran gehenden Arbeiten von BODE et al. konnte bereits gezeigt werden, dass das biosynthetische Gencluster von Xenoamicin, einem Naturstoff aus der Gruppe der zyklischen Depsipeptide, diese Didomäne beherbergt. Eine im Fokus stehende Fragestellung dieser Arbeit befasst sich mit der kristallographischen Strukturaufklärung dieser Tandem-XncTe, die bei einer Auflösung von 3.4 Å hier genauer beschrieben wird. Zudem zeigt eine C-terminale Teilstruktur, bei einer Auflösung von 1.9 Å, Eigenschaften der isolierten Subdomänen auf. Die strukturellen Informationen werden zudem mit dynamischen Eigenschaften in Lösung verknüpft, die unter anderem über Wasserstoff / Deuterium-Austausch massenspektrometrisch eingeordnet werden. Hierbei steht insbesondere die Subdomänen-Anordnung, sowie Te-bekannte Lid-Merkmale im Vordergrund. In einem weiterführenden bioinformatischen Ansatz wird zudem das natürliche Vorkommen der Tandem-Te hervorgehoben und anhand von gesammelten Sequenzinformationen tiefgehender beleuchtet. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wird zudem die proteinbiochemische Charakterisierung der orthologen 2-F4 NRPS Tandem-Te unbekannten Ursprungs beschrieben. Das Ortholog, welches Ähnlichkeit mit der Syringomycin-Synthetase aus Pseudomonas syringae aufweist, wird erstmals erfolgreich rekombinant überproduziert und gereinigt. Hierauf aufbauend wird die gelöste C-terminale Teilstruktur präsentiert, die eine stark konservierte Struktur zur Tandem-Xnc-Te aufweist. Auch konnten hier erste dynamische Untersuchungen durchgeführt werden.