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Der Einfluss von MAGED2 auf NHE3 in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293)
Das transiente antenatale Bartter-Syndrom (taBS, OMIM # 300971) ist eine seltene X-chromosomal vererbte Erkrankung, die durch fetale Polyurie, Polyhydramnion, Frühgeburtlichkeit und transienten postnatalen renalen Salzverlust charakterisiert ist. Verantwortlich sind Mutationen des Maged2-Gens, welch...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2021
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Das transiente antenatale Bartter-Syndrom (taBS, OMIM # 300971) ist eine seltene X-chromosomal vererbte Erkrankung, die durch fetale Polyurie, Polyhydramnion, Frühgeburtlichkeit und transienten postnatalen renalen Salzverlust charakterisiert ist. Verantwortlich sind Mutationen des Maged2-Gens, welches einen Einfluss auf die posttranslationale Modifikation von Kanalproteinen im distalen Tubulus hat. Laghmani et al. konnten zeigen, dass NKCC2 und NCC in ihrer Expression durch mutiertes MAGED2 verringert werden. Grund hierfür scheint könnte eine gestörte Interaktion zwischen MAGED2 und dem Chaperon Hsp40, welches für die effiziente Faltung von NKCC2 und NCC notwendig ist, sein (Laghmani et al. 2016). Der extreme Phenotyp lässt vermuten, dass auch weitere Kanalproteine betroffen sind.
NHE3 ist ein Na+/H+-Antiporter, der maßgeblich für die Na+-Rückresorption im proximalen Tubulus verantwortlich ist. MAGED2 wird im proximalen Tubulus jedoch nur im Fetus expremiert. Die Regulation von NHE3 ist noch nicht gut verstanden. Eine verminderte Aktivität würde infolge verminderter Salzrückresorption mit verminderter Harnkonzentrierung einhergehen. Ziel dieser Arbeit ist, einen etwaigen Einfluss von MAGED2 auf NHE3 zu überprüfen.
Hierzu wurden HEK293-Zellen mit NHE3 und MAGED2 (Wildtyp und Mutante) transfiziert. Mittels SDS-PAGE und Western Blot-Analysen wurden die Proteine über ihre Tags, ihrer Größe entsprechend, identifiziert. Zur Ermittlung einer MAGED2-vermittelten Expression von NHE3 wurden Zellen mit steigenden Dosen MAGED2 (WT und MT) transfiziert. Analysiert wurde die Proteinhalbwertszeit durch Hemmung der Proteinsynthese mittels Cycloheximid (CC) in MAGED2 überexpremierten und knock-down Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Mittels Koimmunpräzipitation (CoIP) wurde nach Protein-Proteininteraktionen gesucht. Eine räumliche Nähe wurde mittels Proximity Ligation Assay (PLA) untersucht. Um die Zelloberflächenintegration zu beurteilen wurden die Zellen mit Biotin behandelt, über welches die Membranproteinfraktion isoliert werden konnte (CSB).
Die Ergebnisse der CoIP und PLA entsprachen sich und deuten darauf hin, dass NHE3 und MAGED2 (WT und MT) einen Komplex bilden. In den CC-Versuchen konnten keine MAGED2 vermittelten Unterschiede in der Halbwertszeit von NHE3 gezeigt werden. Die Dose Response-Versuche zeigten keine Veränderung der intrazellulären NHE3-Mengen abhängig von MAGED2. Auch in der CSB zeigte sich keine verringerte Integration von NHE3 in den mit der MAGED2-Mutante transfizierten Zellen im Vergleich zum Wildtyp.
Wir konnten mit diesen Versuchen zeigen, dass NHE3 mit MAGED2 einen Komplex bildet und eventuell über andere Proteine miteinander interagiert. Anders als bei NCC und NKCC2, hat MAGED2 jedoch scheinbar keinen Einfluss auf die Proteinstabilität, Zelloberflächenintegration von NHE3 oder auf die Gesamt-NHE3-Proteinmenge. NHE3 könnte jedoch in seiner Funktion eingeschränkt sein. Weitere Untersuchungen sollten dies in Betracht ziehen. NHE3 kann bei MAGED2 Versuchen als negative Kontrolle dienen. |
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| Umfang: | 58 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2021.0270 |