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Einfluss von Nukleotiden auf die biologische Aktivität von Cryptochrom 1 aus Arabidopsis thaliana
Während der Durchführung dieser Arbeit wurden verschiedene in-vitro Techniken und Assays benutzt, um die Nukleotidbindung von Cryptochrom 1 aus Arbidopsis thaliana näher zu charakterisieren. Die Fähigkeit von pflanzlichen Cryptochromen, ATP zu binden wurde bereits in 2003 beschrieben (Bouly et al.,...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2021
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Während der Durchführung dieser Arbeit wurden verschiedene in-vitro Techniken und Assays benutzt, um die Nukleotidbindung von Cryptochrom 1 aus Arbidopsis thaliana näher zu charakterisieren. Die Fähigkeit von pflanzlichen Cryptochromen, ATP zu binden wurde bereits in 2003 beschrieben (Bouly et al., 2003) und auch die Bindestelle für ATP konnte in einer Kokristallstruktur von Cryptochrom 1 und AMP-PNP identifiziert werden (Brautigam et al., 2004). Jedoch wurde die ATP-Bindung von Cryptochrom 1 hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die Stabilität der PHR-Domäne nicht weiter untersucht, ebenso nicht die Spezifität der Nukleotide.
Im Zuge dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PHR-Domäne durch die Bindung von ATP und ADP eine kompaktere Struktur einnimmt, welche sowohl den Prozess der Photoreduktion des FAD beschleunigt, als auch das Protein in seiner Gesamtheit stabilisiert. Der stabilisierende Effekt konnte sowohl auf thermischer Ebene über eine Erhöhung der Schmelztemperatur als auch auf molekularer Ebene durch eine erhöhte Resistenz gegenüber der Protease Trypsin nachgewiesen werden.
Des Weiteren wurde über Schmelzpunktbestimmung und Photoreduktionsexperimente der Einfluss weiterer Nukleotide wie NAD(H) und NADP(H) auf diese Prozesse getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Nukleotide keine signifikanten Effekte auf die Photoreduktion und die Proteinstabilität von cry 1 haben. Daher ist auch eine Bindung dieser Nukleotide eher unwahrscheinlich.
Es konnte in dieser Arbeit ferner gezeigt werden, dass die Bindung von Nukleotiden spezifisch für ATP oder dessen Derivate ist. Die Tatsache, dass selbst das strukturell sehr ähnliche GTP in Stabilitätsassays keinen Effekt auf die PHR Domäne von Cryptochrom 1 hat, spricht für die Selektivität der Bindung von Adenin-Derivaten.
Die Verwendung der cry1Y402A PHR Mutante in den Assays zeigte, dass das Tyrosin an Position 402 essentiell für die ATP-Bindung von Cryptochrom 1 ist, da diese Mutante in keinem der Assays auf die Zugabe von ATP (oder anderen Nukleotiden) reagierte.
Für die cry1L407F PHR Mutante konnte gezeigt werden, dass die Hypersensitivität unabhängig von der ATP-Bindung nicht durch eine verstärkte Photoreduktion zurückzuführen ist. Auch das Mimikrieren eines ATP-gebundenen Zustandes konnte anhand der vorliegenden Daten ausgeschlossen werden. Vielmehr ist eine strukturelle Veränderung in der Nähe der ATP-Bindestelle für die Hyperaktivität verantwortlich, wobei der genaue Mechanismus der der Hyperaktivität zu Grunde liegt, nicht abschließend geklärt werden konnte. |
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| Umfang: | 151 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2021.0227 |