Structural Base of Cyclic-Nucleotide Dependent Signalling in Sinorhizobium meliloti

Legume crops undergo a symbiotic relationship with nitrogen-fixing bacteria in order to make atmospheric nitrogen accessible to them. The interaction is mainly controlled by the plant, however the symbiotic bacterium Sinorhizobium meliloti mediates its infection behaviour using cAMP-mediated transcr...

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Main Author: Werel, Laura
Contributors: Essen, Lars-Oliver (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2021
Chemie
Subjects:
Clr
CRP
Online Access:PDF Full Text
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Table of Contents: Die Symbiose von Hülsenfrüchten mit Stickstoff-fixierende Bakterien erlaubt diesen Zugang zu elementarem Stickstoff aus der Atmosphäre. Die Interaktion ist hauptsächlich durch die Pflanze kontrolliert. Zusätzlich wird das Infektionsverhalten auf der Seite des symbiontischen Bakteriums Sinorhizobium meliloti über cAMP-gesteuerte Transkriptionskontrolle beeinflusst. Hierfür besitzt es eine außerordentliche Anzahl von 28 Adenylyl- oder Guanylylzyklasen. Drei von diesen, stehen im Zusammenhang mit der Unterdrückung sekundärer Infektionen – CyaD1, CyaD2 und CyaK. Jede von ihnen enthält die regulatorische Domäne CHASE2, deren Funktion bisher unbekannt ist. Im Umfeld des cyaD1 Gens finden sich weitere Gene, deren Über¬expression oder Deletion einen Einfluss im regulatorischen Mechanis¬mus gezeigt hat. Eines dieser Gene kodiert für den Transkriptionsfaktor Clr, ein cAMP-Rezeptorprotein-Vertreter (Crp), von dem eine Regulation sowohl durch cAMP als auch cGMP beobachtet wurde. Downstream von CyaD1 wurde außerdem ein Gen für eine CpdA-artige Phosphodiesterase identifiziert. Clr ist das erste bifunktionale Crp-Ortholog und der Hintergrund dieser Beson¬derheit ist derzeit unklar. Sie ist von besonderem Interesse, da cGMP-Signalling in Bakterien bisher nur wenig erforscht ist. Ein weiterer interessanter Aspekt ist, dass CpdA in der Literatur als 2‘,3‘-cAMP-spezifisch beschrieben wurde und daher unklar ist welche Rolle es innerhalb des Regulons spielt. Um zum Verständnis der Funktion dieses neuen cAMP- und cGMP-regulierten Prozesses der Sekundärinfektionsunterdrückung und daraus resultierenden Genregulierung beizutragen, wurden in dieser Arbeit die biochemischen und strukturellen Eigenschaften der CyaD1-Lokus-Komponenten untersucht. In Affinitätsmessungen für die Bildung des Clr-Effektor-DNA-Komplexes konnte gezeigt werden, dass in der Anwesenheit von cAMP oder cGMP Target-DNA mit vergleichbarer Affinität an das Protein gebunden wird. In der Kristallstruktur des Komplexes zeigt sich, dass die Bindung beider Nukleotide dieselbe aktive Konformation hervor¬ruft, aber das Effektormolekül in einer etwas anderen Ausrichtung bindet. Die Unterschiede zu anderen Crp-Orthologen sind nicht so groß, dass sie das besondere bifunk¬tionale Verhalten von Clr erklären könnten. Vielmehr ist davon auszugehen, dass eine Veränderung im dynamischen Netzwerk des Proteins dazu führt, dass eine Aktivierung auch durch cGMP möglich wird. Zusätzlich zeigt die Kristallstruktur des Clr ∙ cNMP ∙ DNA-Komplexes, dass der Transkriptionsfaktor direkt mit dem konservierten DNA-Bindemotiv interagiert. HDX-MS-Messungen geben außerdem einen Einblick in die Regionen die in den apo zu holo Übergang involviert sind. Eine phylogenetische Analyse von Crp-Proteinen gibt Hinweise darauf, dass Clr zu einer neuen, bisher unbekannten Unterklasse dieser Transkrip¬tions¬regulatoren gehören könnte, die sich möglicherweise vor allem durch ihre Fähigkeit von cGMP aktiviert zu werden hervorheben. Die Struktur von CpdA aus Sinorhizobium meliloti und die Charakterisierung seiner Aktivität geben neue Einblicke in seine mögliche biologische Funktion. Entgegen vorangegangener Annahmen ist CpdA sehr vielseitig bezüglich seiner Substrate und in der Lage 3‘,5‘-cAMP mit hoher Aktivität zu hydrolysieren. Außerdem zeigt es Aktivität gegenüber 2’,3’-cAMP, 2’,3’-cGMP und 3’,5’-cGMP mit in dieser Reihe abnehmender Effizienz. CpdA ist die erste Phospho¬diesterase der Klasse III die 3’,5‘-cAMP hauptsächlich zu 3‘-AMP und 2‘,3‘-cAMP primär zu 2‘-AMP hydrolysiert. Seine Aktivität wird durch die Zugabe von Mangan erhöht, was möglicherweise seinen nativen Kofaktor darstellt (allein oder heteronuklear mit Eisen). Die Kristallstruktur von CpdA ist erst die zweite Klasse III Struktur die bekannt ist und zeigt deutlich ein katalytisches Hydroxid in der aktiven Tasche. Damit gibt es einen wichtigen Hinweis bezüglich des Mechanismus. Dieser läuft vermutlich über einen SN2-artigen Angriff des zwischen den Metallen koordinierten Hydroxid an das Phosphat des cNMPs ab und nicht wie in E. coli UshA beobachtet über einen asymmetrischen Übergangszustand mit einem weiteren Hydroxid-Nukleophil. Zusätzlich zu diesen Beobachtungen gibt diese Arbeit einen ersten bioinformatischen Einblick in die Struktur der CHASE2 Regulationsdomäne in CyaD1D2K und gibt eine allgemeine Einordnung der oben erläuterten strukturellen Aspekte in das cAMP-gesteuerte Regulon in Sinorhizobium meliloti.