Remodelling regulates the heterochromatin of retrotransposons in mouse embryonic stem cells

Chromatin-Remodeller können Nukleosomen verschieben, zusammenfügen, ausstoßen oder diese restrukturieren, wobei sie die Chromatinstruktur, die Zugänglichkeit der DNA und die Transkriptionsprogramme der Zelle beeinflussen. Der SNF2-like Remodeller SMARCAD1 ist von Hefe bis zu menschlichen Zellen konserviert und wird in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) von Mäusen stark exprimiert. Bei seinem Verlust verlieren Zellen ihren pluripotenten Phänotyp, allerdings ist die Funktion von SMARCAD1 in Stammzellen nicht bekannt. Um die Rolle von SMARCAD1 in embryonalen Stammzellen zu verstehen, wurde ein robustes ChIP-seq-Protokoll für das getaggte und endogene Protein in Wildtyp- und Knockdown-Zelllinien entwickelt. SMARCAD1-Bindungsstellen liegen überwiegend in intergenen Stellen genomweit und überlappen mit repressiven Histonmodifikationen. Unter den mit SMARCAD1-Bindungsstellen angereicherten Chromatin-gebundenen Proteinen befindet sich KAP1 (KRAB-associated protein 1; Krüppel-associated box), ein kritischer Faktor für die Stummschaltung endogener retroviraler Elemente (ERVs) in Maus-ES-Zellen, die Histonmethyltransferase SETDB1 (SET Domain Bifurcated Histone Lysine Methyltransferase I) und die Histonvariante H3.3. Zusammengenommen liefern die entdeckten Bindungsstellen ein neues Verständnis der SMARCAD1-Funktion in ES-Zellen und veranschaulichen, dass SMARCAD1 in der für den pluripotenten Zustand charakteristischen offenen Chromatin-Umgebung mit Transkriptionsrepression assoziiert ist. Ein ungelöstes Problem ist, wie SMARCAD1 ohne DNA-Bindungsdomäne und ohne bekannte Domänen für die Rekrutierung durch Histonmodifikationen mit seinen Bindungsstellen assoziiert. Verschiedene Kategorien von SMARCAD1 Bindungsstellen wurden untersucht und es wurde entdeckt, dass die Rekrutierung von der Interaktion mit KAP1 über die CUE1-Domäne (Coupling of Ubiquitin conjugation to ER degradation) von SMARCAD1 abhängt. Sequenzielle ChIP-Experimente zeigten, dass KAP1 und SMARCAD1 an ihren gemeinsamen Bindungsstellen zugleich angereichert sind. Unter den entdeckten Bindungsstellen des Remodellers SMARCAD1 befinden sich endogene retrovirale Elemente (ERVs), eine häufig vorkommende Art transponierbarer Elemente, die aus viralen Integrationen in der Keimbahn stammen. Die ERV-Expression wird durch repressive Faktoren streng kontrolliert, da sie sonst eine Bedrohung für die Genomstabilität darstellen. Eine Reihe von Knockdown und ChIP-qPCR-Experimenten wurde durchgeführt, um zu verstehen, wie diese Faktoren ERV-Heterochromatin formen. SMARCAD1 wurde als entscheidende Komponente identifiziert; es ist nötig für die Assoziation der repressiven Faktoren KAP1 und SETDB1 zu ERVs der Klassen I und II und folglich für die Erhaltung von den Histonmodifikationen H3K9me3 und H4K20me3. Die Histonvariante H3.3 spielt eine kontroverse Rolle bei der ERV-Kontrolle und wird beim Verlust von SMARCAD1 reduziert, was darauf hindeutet, dass SMARCAD1 an dem Turnover dieser Variante beteiligt sein könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Heterochromatin-Organisation ist gestört, wenn SMARCAD1 nicht auf ERVs vorhanden ist. Das Vorhandensein von H3K9me3 ist andererseits für die SMARCAD1-Bindung nicht erforderlich, wie in einem SETDB1-Knockdown gezeigt. Die Assemblierung von KAP1 und H3K9me3 wird durch die ektopische Expression von Wildtyp-SMARCAD1, jedoch nicht durch eine ATPase-Mutante gerettet. Daher sind es die katalytische Aktivität von SMARCAD1 und das Chromatin-Remodelling, die für die Stummschaltung von ERVs erforderlich sind. Die KAP1-Interaktionsmutante hatte keinen Einfluss auf die Assoziation von KAP1 selbst, konnte jedoch H3K9me3 ebenfalls nicht wiederherstellen, was zeigt, dass SMARCAD1 für eine erfolgreiche Heterochromatinbildung auf ERVs erforderlich ist. Damit ist die Chromatin-Remodellierung als Schlüsselmechanismus der ERV-Kontrolle in Maus-ES-Zellen identifiziert.