Investigations toward the rational modulation of G protein-coupled receptor signalling pathways using in silico methods

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind eine der wichtigsten Protein Familien und wirken als Signaltransduktoren in der Zellmembran. Etwa ein Drittel der heutzutage vermarkteten Wirkstoffe adressiert GPCRs, was ihre Bedeutung für Therapie und Krankheit verdeutlicht. Es ist daher nicht überraschend, dass GPCRs und ihre Signalwege von großem Interesse in der Forschung sind. In dieser Arbeit wurden in silico Methoden angewendet, um die Modulation der GPCR-Signalwege zu untersuchen. Die Modulation der GPCR-Signalwege kann auf verschiedenen Niveaus ansetzen, z.B. bei GPCR Liganden oder bei den weiterführenden Signalwegen. Interaktionen des Rezeptors mit kleinen Molekülen können zu dessen Inaktivierung oder Aktivierung führen. Letzteres kann zur intrazellulären Rekrutierung verschiedener Effektorproteine an den Rezeptor führen, was verschiedene Signalwege in der Zelle auslösen kann. Bestimmte Liganden können dabei eine stärkere Rekrutierung eines Effektorproteins im Vergleich zu anderen bewirken. Auf der strukturellen Ebene ist noch unklar, wie und warum diese Liganden einen solchen Bias bewirken. Überdies sind noch eine Vielzahl weiterer Proteine in die weiterführenden Signalwege von GPCRs verwickelt. Eine dieser Proteinfamilien sind die Regulators for G protein Signalling (RGS), die eine Deaktivierung von G-Proteinen und damit von GPCR-Signalwegen bewirken. Auch wenn bekannt ist, dass Mitglieder dieser Proteinfamilie eine Rolle bei vielen Prozessen und Krankheiten spielen –von denen viele mit GPCR-Signalwegen zusammenhängen–, sind sie noch nicht vollständig verstanden. GPCR-Signalwege müssen auf allen Niveaus besser verstanden werden, um in der Lage zu sein, sie rational zu beeinflussen. In dieser Arbeit wurden zwei GPCRs –der β2-adrenerge Rezeptor (β2AR) und der Cannabinoid Rezeptor 2 (CB2)– sowie ein Mitglied der RGS-Proteinfamilie –RGS7– in fünf verschiedenen Studien mit in silico Methoden addressiert, um ihre Signalwege und deren Modulation zu untersuchen. Zwei der Studien zielten auf den β2AR. Mehr als 30 Strukturen dieses class A-Rezeptors in verschiedenen Aktivierungszuständen sind verfügbar, was umfangreiche strukturelle Untersuchungen ermöglicht. Basierend auf dieser Tatsache wurden drei verschiedene Strukturen des β2AR in unterschiedlichen Aktivierungszuständen unter Anwendung eines komparativen Docking-Ansatzes mit einer Molekülbibliothek addressiert. Ziel dabei war die Vorhersage neuartiger Agonisten dieses Rezeptors, basierend auf der Annahme, dass diese eher aus Docking-Berechnungen gegen eine aktive Konformation des Rezeptors resultieren sollten. Die ausgewählten Moleküle wurden pharmakologisch charakterisiert, was den Erfolg dieser Herangehensweise zeigte. Außerdem zeigte eine retrospektive Analyse dieses Docking-Ansatzes optimale Möglichkeiten auf, um die Chancen der Entdeckung eines neuartigen Agonisten für diesen oder auch andere class A-Rezeptoren zu erhöhen. Das Ziel der zweiten Studie zum β2AR war es, mittels Docking-Berechnungen Antagonisten dieses Rezeptors mit neuartigen Strukturen vorherzusagen. Dieses Projekt wurde in Kollaboration mit InterAx Biotech AG bearbeitet, die auch die pharmakologische Charakterisierung der ausgewählten Moleküle durchführten. Dabei konnte erfolgreich ein Antagonist des β2AR mit bisher nicht beschriebenem Strukturmotiv vorhergesagt werden und eine Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehung zeigte die generelle Affinität von Molekülen mit diesem Strukturmotiv für diesen Rezeptor. Der zweite untersuchte GPCR war der CB2. In einer Studie wurde molekulares Docking angewendet, um strukturell neuartige Liganden für den CB2 zu finden. Dafür wurde zunächst mit Hilfe von bekannten Referenzliganden die Docking-Struktur optimiert. Die Vorhersage von Wasserpositionen in der orthosterischen Bindetasche stellte sich als nützliches Werkzeug zur Optimierung der Docking-Ergebnisse heraus. Die optimierten Docking-Strukturen wurden dann in einem Docking-Screen einer Molekülbibliothek addressiert und verschiedene re-ranking- und Filter-Schritte angewendet, um das enrichment zu verbessern, ähnlich zu der Herangehensweise an den β2AR. Die ausgewählten Moleküle wurden dann von Kollaborationspartnern der Veprintsev-Gruppe der University of Nottingham getestet und die vorläufigen Ergebnisse legen den Erfolg des Screens nahe. In der zweiten Studie wurden Molekulardynamische Simulationen auf den CB2 angewendet, um die strukturelle Basis von Liganden, die einen Rekrutierungs-Bias hervorrufen, zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass es schwierig sein könnte, einen Rekrutierungs-Bias mit dieser Methode nachzuverfolgen, allerdings konnten Anzeichen für Rezeptor-Aktivierung und -Deaktivierung beobachtet werden. In der letzten Studie wurde der RGS7-Gβ5-Komplex durch Docking-Berechnungen addressiert. Das Ziel dabei ist, kleine Moleküle zu finden, die an den Komplex binden und dadurch seine Konformation und möglicherweise Funktion modulieren können. Allerdings sind keine Bindungsstellen für kleine Moleküle an dem Komplex bekannt. Deshalb bestand die Hauptaufgabe der Studie in der Vorhersage und Evaluation möglicher Bindungsstellen. Dabei konnten vielversprechende Taschen identifiziert werden und werden dann in Docking-Screens addressiert und bezüglich ihrer Eignung untersucht. Dieses Projekt wurde in Zusammenarbeit mit der Martemyanov-Gruppe vom Scripps Research Institute in Florida bearbeitet. Die beschriebenen Studien konnten (1) Ideen zur besseren Anwendung von in silico Methoden zum Erreichen der gewünschten Ergebnisse aufzeigen, (2) potentielle Bindestellen kleiner Moleküle an einem wenig untersuchten, aber therapeutisch interessanten, Zielprotein finden, (3) Einsichten in dynamische Prozesse und strukturelle Umordnungen von Rezeptor-Ligand-Interaktionen, die zu einem Signal-Bias führen, liefern und (4) mit Hit-Raten bis zu 37% erfolgreich neuartige Liganden mit unterschiedlichen Eigenschaften für zwei verschiedene Ziel-GPCRs vorhersagen.