From Serendipity to the Rational Design of Protein–Protein Interface Modulators Targeting a tRNA-Modifying Enzyme

Serendipity has played a historically significant role in science and especially in the discovery of new drugs. Chance discoveries have led to important drug developments that characterize the pharmaceutical industry and our current health care system. Over the last decades, the concept of rational...

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Main Author: Nguyen, Dzung
Contributors: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
Subjects:
El
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Table of Contents: Der Begriff der Serendipität spielt in der Wissenschaft und insbesondere bei der Entdeckung neuer Medikamente eine historisch bedeutsame Rolle. So führten Zufallsentdeckungen zu wichtigen Arzneimittelentwicklungen, die die pharmazeutische Industrie sowie unser heutiges Gesundheitssystem prägen. In den letzten Jahrzehnten entwickelte sich das rationale Wirkstoffdesign zu einem der Schlüsselansätze zur Erforschung neuer und spezifischer Arzneistoffe. Dennoch stellt die Inhibitorentwicklung für Protein–Protein-Interaktionen, insbesondere von oligomeren Proteinkontaktflächen, eine besondere Herausforderung dar. Das bakterielle Enzym, tRNA-Guanin-Transglycosylase (TGT), ist ein Beispiel für ein homodimeres Protein und dient in dieser Arbeit als Modell-Zielprotein. Diese Arbeit fasst drei Projekte zusammen, die aus zufälligen Entdeckungen früherer Studien entstanden sind, um neue Ansätze für die Modulation der Homodimerkontaktfläche von TGT zu entwickeln und damit die Grundlage für alternative Inhibitionswege in oligomeren Enzymen zu legen. Eine frühere kristallographische Studie von TGT–Inhibitor-Komplexen enthüllte eine unerwartete, verdrehte Anordnung des TGT-Homodimers. Die gewonnenen Informationen aus den Röntgenkristallstrukturen können jedoch weder kristallographische Artefakte von Kristallpackungskräften ausschließen noch den Übergang zwischen den beiden dimeren Endzuständen aufklären. Daher wurde eine auf der Elektronenspinresonanz (EPR) basierende Methode etabliert, um diesen ligandeninduzierten Umlagerungsmechanismus des TGT-Homodimers in Lösung zu untersuchen (Kapitel 2). Zu diesem Zweck wurden paramagnetische Spinmarker über ortsgerichtete Cystein-Mutationen auf der Proteinoberfläche eingeführt. Die folgenden gepulsten EPR-Techniken ermöglichten die Beobachtung von Inter-Spin-Abstandsverteilungen innerhalb des Homodimers. Während der Studie wurde ein Pyranose-substituierter lin-Benzoguanin-Inhibitor als bester Ligand für die Umwandlung des funktionalen TGT-Dimers in seinen verdrehten Zustand identifiziert. Somit kann die entwickelte Methode zur Differenzierung zwischen der funktionalen und verdrehten TGT-Dimerspezies bei Zugabe von Liganden im Lösungsgleichgewicht eingesetzt werden. Ein zweites Projekt umfasst die Suche nach kleinen Molekülfragmenten, die auf eine neu entdeckte transiente Bindungstasche in der Homodimerkontaktfläche von TGT abzielen (Kapitel 3). In einer früheren Mutationsstudie wurde eine neue Kristallform des TGT-Dimers entdeckt, in der die beiden Protomere durch eine eingeführte Disulfidbrücke kovalent miteinander verknüpft sind. Diese Anordnung bricht die ursprüngliche Dimerkontaktfläche auf und legt eine kleine hydrophobe Bindetasche durch eine Konformationsänderung der nahegelegenen β1α1-Schleife frei. Überraschenderweise war die neu gebildete Tasche von einem Dimethylsulfoxid-Molekül besetzt. In dieser Arbeit wurde eine weitere stabilisierte Variante des Disulfid-gebundenen Dimers für nachfolgende Fragment-Soaking-Studien entworfen, um die neue Bindungstasche zu adressieren. Im Verlauf der Soaking-Experimente wurden die Solvenskanäle des kovalent verknüpften TGT-Dimers in silico analysiert, um die mutmaßlichen Cutoff-Radien kleiner Moleküle abzuschätzen, die in der Lage sind, frei durch den Proteinkristall zu diffundieren. Die strukturelle Charakterisierung der ersten Hits führte zum rationalen Design von Fragmenten mit optimierten Funktionalitäten, die in der Lage sind, die β1α1-Schleife zu modulieren. Darüber hinaus wurden Bindungsstudien mittels magnetischer Kernspinresonanz (NMR)-Techniken durchgeführt. Obwohl mit einer 19F-basierten Methode keine Bindung nachgewiesen werden konnte, wurden die Bindungskonstanten zweier Fragmente mit Hilfe der diffusionsgeordneten Spektroskopie (DOSY) erfolgreich im mikromolaren Bereich abgeschätzt. Während DOSY für zwei der untersuchten Fragmente Bindungsdaten liefert, erweist sich die Röntgenkristallstrukturbestimmung in Kombination mit Soaking-Experimenten als überlegen bei der Identifizierung von Bindungsereignissen von Fragmenten mit niedriger Affinität. Diese Studie verdeutlicht die Herausforderung bei der Charakterisierung schwacher Binder an einer transienten Bindetasche innerhalb des TGT-Homodimers. Das letzte Projekt initiierte das Design von peptidbasierten Modulatoren, die von der Kontaktfläche des TGT-Dimers abgeleitet wurden (Kapitel 4). Die Idee für diesen Ansatz wurde durch eine Kristallstruktur aus dem zweiten Projekt inspiriert, in der N-terminale Aminosäuren, die zuvor undefiniert in der Elektronendichte vorlagen, durch die exponierte Dimerkontaktfläche eines kristallographischen Symmetriepartners strukturell aufgelöst und stabilisiert wurden. Im funktionalen Dimer wird die Position dieses N-terminalen Anhangs von Helix αE eingenommen, die zwei aromatische Reste des dimerstabilisierenden Hotspots enthält. Dies diente als Ausgangspunkt für die Entwicklung von helikalen Peptiden, die in der Lage sind, mit dem nativen Dimerpartner an der Kontaktfläche zu konkurrieren. Zur Bestimmung des Bindungsepitops an der TGT wurde ein Peptid-Microarray verwendet. Anschließend wurden die vielversprechendsten Peptide synthetisiert und durch Fluoreszenzpolarisation in ihrem Bindungsverhalten charakterisiert. Ein Optimierungsansatz wurde durch konformative Peptidzyklisierung unternommen. Um die Modulation der TGT-Dimerisierung zu untersuchen, wurden zwei biophysikalische, jeweils auf MicroScale-Thermophorese und isothermale Titrationskalorimetrie basierende, Assays entwickelt mit denen Änderungen in den Dimerisierungskonstanten verfolgt werden konnten. Darüber hinaus wurde ein Shigella-Wirtszellinvasionsassay etabliert, um die Pathogenität zweier Shigella flexneri-Stämme zu untersuchen. In Zukunft können die etablierten in-vitro-Assays verwendet werden, um Peptide und Wirkstoffkandidaten für die TGT-Inhibition zu testen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Serendipität als Grundlage für die in dieser Arbeit diskutierten Projekte diente. Es konnte gezeigt werden, dass zufällige Entdeckungen aus der Grundlagenforschung genutzt und umgesetzt werden können, um neue Wirkmechanismen aufzudecken oder um neue kleine Molekülfragmente und Peptide als Ausgangspunkt für das gemeinsame Ziel der Modulation herausfordernder Protein–Protein-Interaktionen zu entwerfen.