Biochemical Characterization of the Phoslactomycin modular Polyketide Synthase

Polyketide sind Sekundärmetabolite mit einer großen strukturellen Vielfalt. Sie werden beispielsweise als Mittel gegen Infektionen, Krebs oder Atemwegserkrankungen eingesetzt. Neuentdeckungen, chemische Modifikationen und Engineering von Polyketidbiosynthesewegen kann zu neuen Produkten mit veränderten, potentiell besseren Eigenschaften führen. Die strukturelle Vielfalt von Polyketiden entsteht durch die schrittweise Kopplung von einfachen Bausteinen durch Polyketid-Synthasen (PKS), wobei die Auswahl der Bausteine, wie Malonyl- und Ethylmalonyl-CoA zum Einbau von strukturellen Merkmalen führt. Die Schlüsselenzyme zur Darstellung von Alkylmalonyl-CoAs sind die Enoyl-CoA Carboxylasen/Reduktasen (ECRs). Diese Enzyme katalysieren die Carboxylierung von α,β-ungesättigten Enoyl-CoA Estern, was in der Produktion von z.B. (2S)-EthylmalonylCoA resultiert. In dieser Arbeit wird eine preparative chemo-enzymatische Synthese für diverse Bausteine präsentiert. Die ECR Aktivität wurde mit dem Konzept des biokatalytischen Korrekturlesens zum Wiederverwerten ungewollter Nebenprodukte kombiniert, was die effiziente Produktion einer Auswahl von Polyketid-Bausteinen ermöglicht. Mit den so hergestellten Bausteinen, konnte der grundlegenden Frage, wie der Einbau verschiedener Bausteine vermittelt wird, nachgegangen werden. In dieser Arbeit wurden Tetra-, Penta- und Hexaketide des Phoslactomycin PKS (Pn PKS) in vitro produziert. Das Pn PKS System wurde mit sieben verschiedenen Bausteinen konfrontiert, was zur Identifikation eines promiskuitiven Moduls führte. Detaillierte kinetische Untersuchung einzelner Domänen zeigte, dass die Transacylierungsreaktion der entscheidende Faktor ist, der zum Einbau von Bausteinen führt. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Pn PKS assoziierte Typ II Thioesterase PnG, eine PKS-reinigende Funktion aufweist, die zur höheren Produktion von nativen und nicht nativen Pn Polyketiden in vitro führt. Dies unterstreicht das Potential dieser Enzyme für die Produktion von biosynthetisch veränderten Polyketiden. Zusammenfassend ist diese Dissertation eine detaillierte Untersuchung der Phoslactomycin PKS, beginnend bei der Produktion versatiler Bausteine, über die in vitro Rekonstruierung der Pn PKS, bis hin zur Charakterisierung der zugehörigen Thioesterase und präsentiert neue Einblicke in diese beeindruckende Enzymklasse.