Expanding the repertoire of enzymatic C-C bond formation with one-carbon units

C C-Bindungen sind die Grundlage fast aller organischen Moleküle auf der Erde. In der Natur kata¬lysieren hunderte verschiedener Enzyme Reaktionen, bei denen C C-Bindungen gebildet werden. Eine Hauptaufgabe dieser Enzyme ist die Fixierung von Kohlenstoff, das heißt eine C C Bindungsbildung mit mindestens einem Ein-Kohlenstoff (C1) Molekül. Die meisten dieser Enzyme verwenden elektrophile C1-Spezies, wohingegen nur sehr wenige von nukleophilen oder radikalischen C1-Spezies Gebrauch machen. In dieser Arbeit wurde das Repertoire der enzyma¬tischen C-C-Bindungsbildung um vier neue Beispiele erweitert, von denen drei auf einem C1 Nukleo¬phil und eines auf einem C1-Radikal basieren. Das Thiamin-Diphosphat (ThDP)-abhängige Enzym Oxalyl-CoA-Decarboxylase (OXC) erzeugt ein hochreaktives Carbanion/Enamin-Intermediat, das protoniert und als Formyl-CoA freigesetzt wird. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass dieses Zwischenprodukt auch eine C C Bindungsbil-dung mit einem elektrophilen Carbonylzentrum eingehen kann. Diese Erkenntnis ermöglichte die Entwicklung drei neuer C-C-bindungsbildender Reaktionen. Erstens wurde gezeigt, dass Benzaldehyd als ausgezeichnetes Elektrophil dient und zu Mandelyl CoA führt. In Kombination mit Oxalyl-CoA-Synthetase und einer Thioesterase ermög-lichte dies die Eintopfsynthese von aromatischen (S)-α-Hydroxysäuren mit einem Enantiomeren¬überschuss von bis zu 99%. Zweitens wurde gefunden, dass OXC das Carbanion/Enamin-Intermediat auch aus Formyl-CoA erzeugen kann. Gekoppelt an exergonische Reaktionen und unter hohen CO2-Konzentrationen wurde gezeigt, dass OXC reversibel ist, das heißt, Formyl-CoA zu Oxalyl-CoA carboxylieren kann. Drittens wurde OXC dahingehend engineert, dass es aus dem C1-Molekül Formaldehyd Glykolyl CoA erzeugt. Durch gerichtete Evolution konnte die katalytische Effizienz um einen Faktor von ~200 verbessert werden und die resultierende Enzymvariante wurde erfolgreich in einem Ganz¬zell-Biokatalysator zur Umsetzung von Formaldehyd zu Glykolat eingesetzt. Das Glycylradikalenzym Pyruvatformiat-Lyase (PFL) ist in der Lage, ein Wasserstoffatom von Formiat zu abstrahieren, wodurch ein hochreaktives Formylradikal entsteht, das eine C C Bin-dungsbildung mit einer von Acetyl-CoA stammenden Acetylgruppe eingeht. Hier wurde gezeigt, dass PFL promiskuitive Aktivität mit Glykolyl-CoA aufweist, was in vitro einen Stoffwechselweg ermöglichte, der Glykolat und Formiat zu Glycerat umwandelt. Diese 4 Ergänzungen zur Palette der enzymatischen Bildung von C-C-Bindungen könnten syn-thetische Kohlenstoff-Fixierungswege ermöglichen, und schlussendlich zu einer klimaneutralen Wirtschaft beitragen.