Entwicklung und Charakterisierung von Flavoprotein-basierten optogenetischen Modulen in Saccharomyces cerevisiae

Im letzten Jahrzehnt, wurde in der Wissenschaft dem Bereich der Optogenetik immer mehr Beachtung geschenkt. So wurden zahlreiche Anwendungen entwickelt, von lichtgesteuerten Ionenkanälen, über Module zur Kontrolle des Proteinlevels, bis zu Modulen um physiologische Prozesse mit Licht zu steuern. All...

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Main Author: Hepp, Sebastian
Contributors: Essen, Lars-Oliver (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
Chemie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Im letzten Jahrzehnt, wurde in der Wissenschaft dem Bereich der Optogenetik immer mehr Beachtung geschenkt. So wurden zahlreiche Anwendungen entwickelt, von lichtgesteuerten Ionenkanälen, über Module zur Kontrolle des Proteinlevels, bis zu Modulen um physiologische Prozesse mit Licht zu steuern. All diese Module basieren auf Proteinen, die als Photorezeptoren bezeichnet werden und als Sensordomäne sensitiv für Licht bestimmter Wellenlängen sind. Eine weitverbreitete Familie dieser Proteine sind die LOV-Domänen, welche zu den Blaulichtrezeptoren zählen und aufgrund ihrer geringen Größe (unter 20 kDa) von besonderem Interesse für optogenetische Anwendungen sind. Eine weitere Proteinfamilie, die immer mehr in das Interesse für die Optogenetik rückt, sind die Cryptochrome, welche ebenfalls zu den Blaulichtphotorezeptoren gezählt werden. In dieser Arbeit ist die Entwicklung von optogenetischen Modulen basierend auf der LOV-Domäne des Aureochroms 1a aus Phaeodactylum tricornutum (AuLOV) beschrieben. Dafür wurden verschiedene Mutanten der AuLOV-Domäne strukturell und proteinchemisch charakterisiert. Bei dieser Charakterisierung konnte eine neue Dimerinteraktionsfläche für die AuLOV-Domäne durch Kristallstrukturanalyse gefunden werden. Diese neue Dimeranordnung wurde anschließend bioinformatisch charakterisiert. Für die Entwicklung von einer optogenetischen Applikation wurden verschiedene AuLOV Mutanten im psd-Modul getestet und eine Domäne entwickelt, die das Protein in Dunkelheit destabilisiert (AuLOVV254M/V349W-cODC1CA). Diese Domäne wurde mit der photoaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC fusioniert und AuPAC wurde als zweites Modul geschaffen. AuPAC ist eine synergistische, photoaktivierbare Adenylatcyclase, die gezielt über den Proteinkinase A Signalweg zelluläre Funktionen in S. cerevisiae steuert. Im Folgenden wurde ein lösliches in vivo Konstrukt mCherry-P2A-AuLOV-cODC1 gereinigt und proteinchemisch charakterisiert. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem „animal-like Cryptochrome“ aus C. reinhardtii (CraCry), welches aufgrund der verschiedenen Redoxzustände des Chromophors möglicherweise zusätzlich als Rotlichtphotorezeptor fungieren kann. Varianten von CraCry wurden im psd-Modul auf das Verhalten unter verschiedenen Lichtbedingungen in S. cerevisiae untersucht und bieten somit ein Potenzial für eine Vielzahl weiterer optogenetischen Applikationen.
Physical Description:142 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2020.0656