Neue Ansätze zur Entwicklung von Modulatoren der homodimeren tRNA-Guanin-Transglycosylase

Das Ziel dieser Dissertation war die biophysikalische Charakterisierung einer Dimerstruktur am Beispiel der tRNA-Guanin-Transglycosylase (TGT). Für die intensive Untersuchung des Dimers wurden neben der Röntgenkristallographie auch enzymkinetische Messungen, isotherme Titrationskalorimetrie, native...

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Main Author: Nguyen, Andreas
Contributors: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
Pharmazeutische Chemie
Subjects:
ITC
TGT
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Das Ziel dieser Dissertation war die biophysikalische Charakterisierung einer Dimerstruktur am Beispiel der tRNA-Guanin-Transglycosylase (TGT). Für die intensive Untersuchung des Dimers wurden neben der Röntgenkristallographie auch enzymkinetische Messungen, isotherme Titrationskalorimetrie, native Massenspektrometrie, Thermal-Shift-Assays und proteinbasierte 19F-NMR-Spektroskopie zur Untersuchung und Einflussnahme auf die Dimer- stabilität durch die verwendeten Liganden eingesetzt. Die Z. mobilis TGT katalysiert als Homodimer den Einbau einer modifizierten Base in die tRNA. Diese Modifikation ist von wesentlicher Bedeutung in der Pathogenese der entzünd- lichen Darmerkrankung Bakterienruhr, die durch Shigellen verursacht wird. Dazu tauscht die TGT die Purinbase Guanin in der Wobble -Position-34 von tRNAsAsn,Asp,His,Tyr durch die modifi- zierte Base preQ1aus. Das von der Purinbase abgeleitete lin-Benzoguanin-Grundgerüst bindet kompetitiv in das aktive Zentrum des Proteins. Durch Einfügen von Modifikationen an C(2') bzw. C(4') können die angrenzenden Ribose-33/Uracil-33- und Ribose-34/Phosphat-35-Seiten- taschen adressiert werden. Dadurch dass die TGT das natürliche tRNA-Substrat nur im Verhältnis 2:1 (Monomer:tRNA) als Homodimer katalytisch umsetzen kann, stellt die Stabilisierung der Quartärstrukur in einer inkompetenten Anordnung neben der klassischen Blockierung des aktiven Zentrums eine alternative Form der Inhibition dar. Die Kontaktfläche der beiden TGT-Monomere (Dimer- Grenzfläche) befindet sich in unmittelbarer Nähe zur Ribose-34/Phosphat-35-Tasche. Durch Adressierung des hydrophoben Bereichs der vorherig erwähnten Tasche kann ein angrenzende Schleifen-Helix-Motiv in seiner Geometrie gestört werden, wodurch die mit einer massiven Umlagerung von bis zu 20 Aminosäuren verbundene Dimerstabilität reduziert wird. Drei Liganden wurden kristallographisch identifiziert, die durch ihre Bindung in der Ribose-34- Tasche eine "verdrehte" Anordnung des TGT-Dimers (twisted dimer ) induzieren, wodurch die katalytische Aktivität aufgrund der Neuausrichtung nicht mehr möglich sein sollte. Mit Ein- führung einer Fluor-Sonde innerhalb des Dimers wurde das "verdrehte" Dimer unter nativen Bedingungen in Lösung untersucht (Kapitel 2). Die Ergebnisse der 19F-NMR deuten darauf hin, dass das Schleifen-Helix-Motiv und dort vor allem der Rest Trp95 eine regulative Funktion in der Dimeranordnung bzw. -bildung tragen. Daher stellt die Modulation des formbaren Mo- tivs mit geeigneten Liganden eine ideale Vorgehensweise zur Inhibition des Dimerproteins dar. Innerhalb der Ribose-33/Uracil-33-Tasche wurde ein Wassernetzwerk durch Bindung von C(2')-Monosaccharid-modifizierten lin-Benzoguanin-Inhibitoren ladungsneutral ersetzt (Ka- pitel 3). Es zeigte sich zudem, dass Acetonid-geschützte Zuckermotive eine entscheidende Rolle zur Stabilisierung eines [5+5+4] Wasserclusters spielen und dadurch die Bindungsaffinität dereingesetzten Liganden signifikant beeinflussen. Neben der Bindungsaffinität, steigert das einge- setzte Motiv die physikochemischen Eigenschaften der lin-Benzoguanin-Liganden. Aufbauend auf einer früheren Studie wurde die TGT-Mutante Y330C eingeführt. Die unter- suchte Kristallstruktur erlaubt zwar nicht die vollständige Strukturaufklärung des TGT- Monomers, zeigt aber eine Anordnung der Moleküle in der Raumgruppe P6522 in einer weit- gehend konformationsfreien Anordnung in der ursprünglichen Dimer-Grenzfläche. Inte- ressanterweise wird die β1α1-Schleife (Thr47 - Lys55) in einer zuvor nicht beobachteten Konformation beobachtet. Die neue Anordnung der Schleife ist mit der Ausbildung der funktionalen Dimer-Grenzfläche nicht kompatibel. Daher bleibt die Bestimmung der Mono- merstruktur ein noch zu lösendes Problem. Hierzu wurde ein MS-gekoppeltes Tethering- Screening an der Position Cys330 angewandt und die Suche nach optimalen Kristallisierungs- bedingungen durchgeführt (Kapitel 4). Neben der Anwendung reversibler Disulfid-Binder, wurde das Konzept durch die Einführung von irreversiblen Bindern erweitert. Es stellte sich heraus, dass angewandte Acrylamide ein hohes Potenzial zur Modifikation von Cysteinresten besitzen und unabhängig von der Affinität des Fragments zum Zielprotein binden. Dies eröffnet eine neue Perspektive für Möglichkeiten der Dimer-Untersuchung. Die Funktionalität der TGT ist nur in der dimeren Anordnung gewährleistet. Somit erscheint die Regulierung der Dimerbildung eine Möglichkeit zur Hemmung ihrer katalytischen Fähigkeit zu sein. Es wurde ein aus vier aromatischen Aminosäuren (Phe92', Trp326, Tyr330, His333) bestehender Cluster identifiziert, der für die Stabilität der Dimer-Grenzfläche essentiell ist. Durch die eingeführten Phenylalanin-Mutanten wurden die Wasserstoffbrücken gezielt entfernt, während der aromatische Charakter der Reste beibehalten wird (Kapitel 5). Die Wirkung auf die Dimer-Grenzfläche wurde durch Röntgenkristallstrukturanalyse, native Massenspektrometrie, Enzymkinetik und Bestimmung der Schmelztemperatur der jeweiligen Mutanten untersucht. Von größerer Bedeutung scheint die Position His333 zu sein, dessen Protonierungsszustand die Stabilität der die Dimer-Grenzfläche stark beeinflusst. Diese Erkenntnis beruht auch auf der Erfahrung, dass Kristalle, die bei pH 5.5 gezüchtet werden, eine ausgeprägtere Veränderung des strukturellen Schleifen-Helix-Motivs aufweisen. Darüber hinaus zeigt die Mutationsstudie, dass der Trp95-Rest, der sich in der Mitte des Schleifenhelix- Motivs befindet, in Bezug auf die Dimer-Regulation essentiell zu sein scheint. Die Reduzierung dieses Restes zu Phenylalanin bewirkt eine signifikante Verringerung der Schmelztemperatur >15 °C. Weiterhin werden Dimerisierungsrate, Strukturstabilität des Schleifen-Helix-Motivs und Bindungsverhalten von unterschiedlich substituierten Liganden die in Kapitel 2 genauer charakterisiert werden, deutlich beeinflusst.
Physical Description:196 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2020.0517