Cryptochrom 3 aus Arabidopsis thaliana - Kofaktoren, Lokalisation und Funktion in planta

Cry3 aus Arabidopsis thaliana ist eines der ersten identifizierten DASH Cryptochrome (Kleine et al., 2003). Trotzdem war die biologische Funktion von cry3 bisher weitgehend unbekannt und die Frage, ob es sich um einen Photorezeptor handelt, offen. Die meisten verfügbaren Daten basieren auf heterolog...

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Main Author: Göbel, Tanja
Contributors: Batschauer, Alfred (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
Biologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Cry3 aus Arabidopsis thaliana ist eines der ersten identifizierten DASH Cryptochrome (Kleine et al., 2003). Trotzdem war die biologische Funktion von cry3 bisher weitgehend unbekannt und die Frage, ob es sich um einen Photorezeptor handelt, offen. Die meisten verfügbaren Daten basieren auf heterolog exprimiertem cry3. Die immunologische Präzipitation von in planta exprimiertem cry3-GFP ermöglichte es, die Cofaktoren fluorimetrisch zu charakterisieren und als MTHF und FAD zu bestätigen. Somit scheint das in E. coli exprimierte und mit His-tag fusionierte cry3 ein valider Stellvertreter für das in der Pflanze synthetisierte Protein zu sein und die gewonnenen in vitro Daten auf die Situation in planta übertragbar. Um weitere Anhaltspunkte über die biologische Funktion zu erhalten, wurde die Expression und Lokalisation von cry3 untersucht. Die relative Transkriptmenge von CRY3 wird durch alle getesteten Lichtqualitäten transient erhöht, mit einem Maximum etwa zwei Stunden nach Einsetzen der Belichtung. An der Regulation der Transkriptmenge von CRY3 ist neben cry1, cry2 und UVR8 besonders phyA maßgeblich beteiligt, auch unter Rotlicht. Untersuchungen einer cry3-Deletions-Mutante ergaben einen geringen aber reproduzierbaren Einfluss auf die Inhibierung der Hypokotylelongation während der Deetiolierung von Keimlingen. Die Keimlinge der cry3-Mutante reagierten dabei schwächer auf Blaulicht. Eine Komplementation der Mutante scheiterte zwar, doch auch das Chloroplastenproteom der cry3-Mutante zeigte in einer 2D-DIGE Analyse Unterschiede zum Wildtyp. Western Blots konnten dieses Ergebnis untermauern, wenn auch der Unterschied zwischen Wildtyp und cry3 Mutante nur in Chloroplastenextrakten und nicht in Gesamtextrakten ersichtlich war. Zusammengenommen sprechen die Phänotypen der cry3-Mutante für eine Funktion von cry3 als Photorezeptor. Während zunächst angenommen wurde, dass cry3 hauptsächlich in Chlorpolasten und Mitochondrien vorkommt, konnte cry3-GFP hier auch im Zellkern (und dabei speziell dem Nukleolus) gefunden werden und liegt somit in allen DNA enthaltenden Kompartimenten vor. Dies ist besonders interessant da cry3 in vitro einzelsträngige DNA und RNA binden kann (Pokorny et al., 2008). In Chloroplasten konnte cry3 hauptsächlich als lösliches Protein im Stroma gefunden werden. Das Elutionsverhalten in einer SEC deutet zudem darauf hin, dass cry3 an einen großen, löslichen Komplex assoziiert ist. Eine genaue Identifizierung dieses Komplexes steht aus. Über eine CoIP mit Chloroplastenextrakten wurde versucht, mögliche Interaktionspartner von cry3-HA und cry3-GFP zu finden. Die massenspektrometrische Analyse der Eluate führte jedoch zu keinen eindeutigen Befunden. In einem Y2H library screen wurde eine cDNA-Bibliothek überprüft und zwei spezifische Interaktionspartner gefunden. Bei den Kandidaten handelt es sich um NUP205, ein Kernporenprotein und DPE2, ein cytosolisches Protein des Stärkemetabolismus. Weitere Untersuchungen müssen die Y2H Daten verifizieren und zeigen in wieweit diese Protein an einer biologischen Funktion von cry3 beteiligt sind.
Physical Description:216 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2020.0508