2020-10-20 Preliminary efforts of the working group showed that the inhibition of different components of the FGFR-Rho-ROCK-Myosin II signaling pathway results in the same phenotype and prevents bud detachment in Hydra. It was demonstrated that budding is a complex, precisely timed process that ultimately results in the accumulation of actin at the bud base, which correlates with myosin II phosphorylation (Holz et al., 2017; Holz et al., 2020). Small Rho- GTPases act as main regulators of actin dynamics and actomyosin contraction (Fagotto, 2014; Fagotto et al., 2013; Menke and Giehl, 2012). A database search of the human RhoA- GTPase using BLAST surprisingly identified four homologous Rho- GTPases in Hydra. Phylogenetic studies showed that Hv_Rho1-3 clearly group within the RhoABC subfamily, while Hv_Rho4 is basal to the subfamily. In-situ-hybridization revealed that the four Rho- GTPases are expressed in morphologically active tissue regions, whereby Hv_Rho1 and Hv_Rho2 in particular are probably involved in cellular processes at the bud base. In addition to immunohistochemical antibody staining, the fusion protein RBD-GFP is effective to detect active RhoA. RBD-GFP specifically binds to active RhoA through the Rho-binding-domain (RBD) (Berger et al., 2009). RBD-GFP was expressed, purified and established as a new method to identify active RhoA- homologous Rho- GTPases in fixed Hydra tissues, such as evaginating bud or tentacle tissue or contracting tissue at the bud base or during regeneration. The in-silico analysis of the Rho- GEFs Kalirin and Trio illustrated a complex and evolutionarily interesting development of the Rho- GEFs in terms of dynamic losses and gains of specific protein domains. Interestingly only one Kalirin- homologous sequence was detectable in Hydra, which possibly mediates the connection between membrane-bound lipids and the Rho- GTPases. In addition to the Rho-ROCK-Myosin II signaling pathway, the involvement of phosphatidylinositol phosphates (PtdInsP) in morphological processes in Hydra was investigated. Generated transgenic Hydra- lines serve as a valuable tool to observe the activity of Phopholipase C (PLC) and PI3- kinase live and in vivo. The use of such transgenic lines demonstrated the activity of PLC at the bud base during budding, as well as a dynamic activity of the PI3- kinase at the interface during regeneration. Furthermore, the PtdInsP- sensors verified the apical localization of PtdIns(4,5)P2 as well as the basal localization of PtdIns(3,4,5)P3. To permit detailed in vivo observation and especially the in vivo microscopy of PtdInsP-GFP- sensors and their cellular localization, different relaxants were tested. Only linalool and benzocaine achieved an effective immobilization for Hydra. Both relaxants showed no significant influence on the process of budding or wound closure after incision. However, analysis of the actin fibers showed that linalool, in contrast to benzocaine, disturbed the polyp's actin cytoskeleton, leading to incorrect fiber orientation and significant reduction of fiber length. Based on existing tools for the analysis of morphogenesis in vertebrates and flies, the fusion protein RBD-GFP and the PtdInsP-GFP- sensors, were established as two interesting methodological tools for Hydra. For the first time, the activity of the Rho- GTPases at the bud base, as well as the cellular localization of PtdIns(4,5)P2 and PtdIns(3,4,5)P3 in ectodermal epithelial cells, could be demonstrated. The established methods are useful for detailed investigation of the Rho- GTPases, as well as the PLC and PI3- kinase signaling pathways and their functions during morphogenetic processes in Hydra. Furthermore, an effective immobilization and relaxation protocol that is gentle on actin fibers was developed for Hydra using Benzocaine. In the future, this could be convenient for in vivo microscopy and mechanical manipulation, such as incision of the polyp for regeneration. monograph German opus:9401 Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg Rho- GTPases Phosphatidylinositolphosphates PIPs Relaxantien Linalool Benzocaine Hydra vulgaris urn:nbn:de:hebis:04-z2020-04996 2020-10-20 Apel, David Apel David Fachbereich Biologie Neue Werkzeuge für Hydra zur Untersuchung von Rho- und PtdInsP- vermittelten Signalwegen doctoralThesis https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2020/0499/cover.png New tools for the investigation of Rho- and PtdInsP- mediated signal pathways in Hydra ths Prof. Dr. Hassel Monika Hassel, Monika (Prof. Dr.) 243 application/pdf Life sciences Biowissenschaften, Biologie Philipps-Universität Marburg 2020-09-30 https://doi.org/10.17192/z2020.0499 2020 Rho- GTPasen Phosphatidylinositolphosphate PIPs Relaxantien Linalool Benzocain Hydra vulgaris In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die Inhibition unterschiedlicher Komponenten des FGFR-Rho-ROCK-Myosin II- Signalweges jeweils den gleichen Phänotyp bei Hydra erzeugt und das Ablösen der Knospe verhindert. Dabei konnte deutlich gemacht werden, dass die Knospung ein komplexer, zeitlich exakt abgestimmter Prozess ist, der final in einer Akkumulation des Aktins an der Knospenbasis resultiert, die mit der Phosphorylierung von Myosin II korreliert (Holz et al., 2017; Holz et al., 2020). Ein Hauptregulator der Aktindynamik und der Aktomyosin-Kontraktion sind die kleinen Rho- GTPasen (Fagotto, 2014; Fagotto et al., 2013; Menke und Giehl, 2012). Durch eine Datenbankanalyse mittels BLAST der humanen RhoA- GTPase konnten vier homologe Rho- GTPasen in Hydra identifiziert werden. Phylogenetische Untersuchungen zeigten, dass sich Hv_Rho1-3 deutlich innerhalb der RhoABC- Subfamilie gruppieren, während sich Hv_Rho4 basal zu der Subfamilie einordnet. In-situ-Hybridisierungen zeigten, dass die vier Rho- GTPasen in Hydra an morphogenetisch aktiven Geweberegionen exprimiert werden, wobei vor allem Hv_Rho1 und Hv_Rho2 vermutlich an zellulären Prozessen an der Knospenbasis beteiligt sind. Um aktives RhoA nachzuweisen kann neben der immunhistochemischen Antikörperfärbung das Fusionsprotein RBD-GFP genutzt werden, welches durch die Rho-Binde-Domäne (RBD) spezifisch an aktives RhoA bindet (Berger et al., 2009). Das exprimierte und aufgereinigte Fusionsprotein RBD-GFP konnte als neue Methode zur Detektion von aktiven RhoA- homologen Rho- GTPasen in fixiertem Hydra-Gewebe etabliert werden. Dadurch konnten aktive RhoA- homologe Rho- GTPasen in evaginierenden- (Knospe oder Tentakel) und kontrahierenden Geweben (Knospenbasis und Regeneration) nachgewiesen werden. Die in-silico Analyse der Rho- GEFs Kalirin und Trio verdeutlichte eine komplexe und evolutionär interessante Entwicklung der Rho- GEFs, bezüglicher dynamischer Verluste und Gewinne von spezifischen Proteindomänen. In Hydra konnte interessanterweise lediglich eine Kalirin- homologe Sequenz identifiziert werden, welches möglicherweise die Verbindung zwischen membranständigen Lipiden und Rho- GTPasen vermittelt. Neben dem Rho-ROCK-Myosin II- Signalweg wurde die Beteiligung der Phosphatidylinositolphosphate (PtdInsP) an morphogenetischen Prozessen in Hydra untersucht. Erzeugte transgene Hydra- Linien dienen als wertvolles Werkzeug, um die Aktivität der Phopholipase C (PLC) und der PI3- Kinase live und in vivo beobachten zu können. So konnte die Aktivität der PLC an der Knospenbasis während des Knospungsprozesses sowie die Aktivität der PI3- Kinase an der Schnittstelle während der Regeneration nachgewiesen werden. Weiterhin konnte mit erzeugten PtdInsP-GFP- Sensor Transgenen die apikale Lokalisation des PtdIns(4,5)P2 sowie die basale Lokalisation des PtdIns(3,4,5)P3 nachgewiesen werden. Zur detaillierten in vivo Beobachtung und vor allem zur in vivo Mikroskopie der zellulären Lokalisation der PtdInsP-GFP- Sensoren wurden unterschiedliche Relaxantien getestet, wobei lediglich Linalool und Benzocain eine effektive Immobilisierung bei Hydra erzielten. Beide Relaxantien hatten keinen signifikanten Einfluss auf den Prozess der Knospung oder auf den Prozess des Wundverschlusses nach einem Einschnitt. Die Analyse der Aktinfasern verdeutlichte jedoch, dass Linalool im Gegensatz zu Benzocain, das Aktinzytoskelett des Polypen störte, indem es die Faserlänge deutlich verkürzte und zu einer fehlerhaften Faserorientierung führte. Die Daten der vorliegenden Arbeit zeigen, dass mit dem Fusionsprotein RBD-GFP und mit den PtdInsP-GFP- Sensor transgenen Hydren basierend auf existierenden Werkzeugen für die Analyse der Morhphogenese bei Vertebrata und Fliege, zwei interessante methodische Werkzeuge für Hydra etabliert werden konnten. Erstmals konnte dadurch die Aktivität der Rho- GTPasen an der Knospenbasis während der Knospung sowie die zelluläre Lokalisation von PtdIns(4,5)P2 und PtdIns(3,4,5)P3 in den ektodermalen Epithelmuskelzellen nachgewiesen werden. Die etablierten Methoden können zukünftig weiterhin der detaillierten Untersuchung der Rho- GTPasen, sowie der PLC- und PI3- Kinase- Signalwege und deren Funktionen während morphogenetischer Prozesse in Hydra dienen. Zusätzlich konnte für das Relaxans Benzocain ein Protokoll zur effektiven und Aktinfaser- schonenden Immobilisierung und Relaxierung von Hydra erarbeitet werden. Dieses kann zukünftig zur in vivo Mikroskopie, aber beispielsweise auch als Relaxans zur mechanischen Manipulation, wie dem gezielten Einschneiden des Polypen zur Regeneration, genutzt werden. Biologie