Increasing structural diversity by prenylation-based modifications

Pilze besitzen die Fähigkeit hoch komplexe und diverse Naturstoffe zu produzieren. Pilzliche Sekundärmetabolite sind von hoher Relevanz im täglichen Leben von Menschen und spielen eine wichtige Rolle in Medizin, Landwirtschaft und Industrie. Seit der Entdeckung der Antibiotika in der ersten Hälfte des letzten Jahrhunderts wurde eine Vielzahl von verschiedenen Naturstoffen aus Pilzen isoliert. Mit dem Aufkommen der genomischen Revolution wurde es für Wissenschaftler deutlich, dass die bemerkenswerte Varianz und Vielfalt der pilzlichen Sekundärmetabolite aus der Diversifizierung von biosynthetischen Genclustern (BGCs) resultiert. Enzyme, als effiziente Katalysatoren, bilden die Brücke zwischen diesen Genen und den resultierenden niedermolekularen Verbindungen. Die anfänglichen Grundgerüste werden durch sogenannte „Backbone“-Enzyme konstruiert und durch weitere Enzyme zu den jeweiligen Endprodukten modifiziert. Ein Vertreter dieser modifizierenden Enzyme ist die Prenyltransferase. „Aromatische“ Prenyltransferasen akzeptieren diverse Substrate, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Indolderivate, Benzaldehyde und Naphthaline. Prenylierte Metabolite können durch enzymatische oder nichtenzymatische Reaktionen weiter modifiziert werden, um die Vielfalt der funktionellen Gruppen zu erhöhen. Um die Komplexität und strukturelle Vielfalt von Naturstoffen zu verstehen, sind daher Untersuchungen der gesamten Biosynthesewege, sowie der beteiligten Enzyme und ihrer Mechanismen erforderlich. Es gibt umfangreiche Studien, die die Diversifizierung enzymatischer Postmodifikationen an Prenyleinheiten demonstrieren. Die nicht-Häm-FeII / 2-Oxoglutarat (2-OG) abhängige Oxygenase FtmOx1 aus Aspergillus fumigatus ist, z.B. an der Biosynthese der Mykotoxine vom Fumitremorgin-Typ beteiligt und katalysiert die Bildung eines Endoperoxids durch Insertion eines Sauerstoffmoleküls zwischen zwei Prenylresten. Darauf aufbauend haben wir ein homologes Gen NFIA_045530 aus Neosartorya fischeri kloniert und überexprimiert. Das von NFIA_045530 kodierte rekombinante Protein EAW25734 wurde zur Homogenität gereinigt und mit den Intermediaten des Fumitremorgin-Biosynthesewegs inkubiert. Die LC-MS Analyse zeigte keinen Umsatz von Fumitremorgin B, dem natürlichen Substrat von FtmOx1, allerdings aber einen guten Umsatz mit seinem Vorstufe Tryprostatin B in Anwesenheit von FeII und 2-OG. Die Strukturaufklärung bestätigte die drei Produkte als 22-Hydroxylisotryprostatin B, 14- Hydroxylisotryprostatin B und 14,22-Dihydroxylisotryprostatin B. Detaillierte biochemische Untersuchungen zeigten, dass die nicht-Häm-FeII / 2-Oxoglutarat abhängige Oxygenase EAW25734 die Doppelbindungsverschiebung innerhalb der Dimethylallyl-Einheit und gleichzeitige Hydroxylierung katalysiert. Als Reaktionsmechanismus haben wir eine radikale Umlagerung vorgeschlagen, bevor ein an das FeIII gebundene Hydroxylradikal übertragen wird. Durch Markierungsexperimente wurde bestätigt, dass der Sauerstoff an C14a und C22 hauptsächlich aus O2 stammt. Für C22-OH wurde ein Austausch des Sauerstoffs mit H2O nachgewiesen. LC-MS Analyse der Pilzkultur bestätigte das Vorhandensein von 22-Hydroxylisotryprostatin B, was darauf schließen ließ, dass EAW25734 Tryprostatin B aus der Fumitremorgin-Biosynthese abzweigt. In einer Kooperationsstudie mit Dr. Jinglin Wang haben wir eine spontane Umlagerung von 4-Dimethylallyl-1,3-Dihydroxynaphthalin zu zwei Tetrahydrobenzofuran- und einem Bicyclo[3.3.1]nonan-Derivat untersucht. Inkubation von FgaPT2, 1,3-Dihydroxynaphthalin und DMAPP unter 18O2-angereicherter Atmosphäre und mit 18O-angereichertem Wasser bestätigten, dass die beiden zusätzlichen Hydroxylgruppen von einem O2-Molekül stammten. Daher wurde ein Mechanismus vorgeschlagen, der mit einem reaktiven C4-Peroxyl-Zwischenprodukt beginnt, zu Radikalverschiebungen und zur Bildung trizyklischer Produkte führt. Diese Ergebnisse liefern ein weiteres Beispiel für die nichtenzymatische oxidative Zyklisierung und geben wertvolle Einblicke in die strukturelle Diversifizierung durch spontane Reaktionen. In Kooperation mit Jonas Nies wurde das fog-Gencluster in Aspergillus ruber entdeckt, das insgesamt neun Gene umfasst. Durch Genome-mining wurde darin auch das Prenyltransferasengen fogH identifiziert. Durch heterologe Expression in Aspergillus nidulans konnte gezeigt werden, dass das fog-cluster für die Biosynthese von dem prenylierten Salicylaldehyd Flavoglaucin und Analoga verantwortlich ist. Gendeletionsexperimente im heterologen Expressionsstamm deuteten darauf hin, dass die hoch-reduzierende Polyketidsynthase FogA zusammen mit drei zusätzlichen Enzymen für die Bildung der Benzylalkohol-Zwischenprodukte verantwortlich ist. Die Deletion von fogH führte zur Akkumulation von instabilen C5-hydroxylierten Hydrochinonen, die teilweise zu ihren Benzochinonformen oxidierten. Die biochemischen Untersuchungen zur Prenyltransferase FogH ergab, dass diese sowohl die Hydrochinon- als auch die Benzochinonform als Substrate akzeptieren kann. Anschließend wurden die Alkohole durch eine Oxidase, die nur prenylierte Intermediate als Substrate akzeptiert, zu den endgültigen Aldehydprodukten oxidiert. Des Weiteren konnte während der Isolierung in geringer Menge die spontane Oxidoreduktion von prenylierten Benzochinonalkoholen zu endgültigen Hydrochinonaldehyden beobachtet werden. Diese Studie zeigt die hocheffiziente und programmierte Maschinerie zur Biosynthese von Flavoglaucin und Analoga und hebt vor allem die Bedeutung der Prenyltransferase FogH im gesamten Kontext hervor. In dem Übersichtsartikel haben wir die strukturellen Besonderheiten, Verbreitung, biologische Aktivitäten und Biosynthese pilzlicher Benzaldehyde zusammengefasst. Der Schwerpunkt lag auf alkylierten Derivaten mit unterschiedlichen Alkylketten (C3, C5, C7, C9 oder C11) an der ortho-Position zur Aldehydgruppe und Meroterpenoiden mit Strukturelementen aus einem C5-, C10- oder C15-Prenylrest. Einfache Benzaldehyde, Benzophenonaldehyde und spirozyklische Benzaldehyde wurden ebenfalls behandelt. Die meisten der besprochenen Substanzen sind Salicylaldegydderivate, die von Polyketidsynthasen aus Schlauchpilzen synthetisiert werden. Diese werden entweder direkt als Aldehyde freigesetzt oder durch Modifikationsenzyme nachträglich oxidiert/reduziert.