Understanding metabolic robustness of Escherichia coli using genetic and environmental perturbations

Metabolism provides the essential biochemical intermediates and energy that enable life and its growth. In this thesis we studied robustness of Escherichia coli metabolism, by perturbing it with different methods and measuring the response at a molecular level. In Chapter 1, we introduce the latest...

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Main Author: Donati, Stefano
Contributors: Link, Hannes (Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
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Table of Contents: Der Stoffwechsel, oder auch Metabolismus, stellt die essentiellen Bausteine und die Energie bereit, die Leben und zelluläres Wachstum voraussetzen. In dieser Doktorarbeit wurde die Robustheit des Metabolismus von Escherichia coli untersucht, indem er mit verschiedenen Methoden perturbiert und die zelluläre Antwort auf molekularer Ebene verfolgt wurde. In Kapitel 1 werden die neuesten Erkenntnisse über die Regulation und Optimalität des Metabolismus in mikrobiellen Modellorganismen betrachtet. Zusammenfassend ließen sich zwei große Probleme feststellen: Zum einen die niedrige Zahl an nachgewiesenen Metabolit-Protein Interaktionen und zum anderen die unbekannten Ziele, auf deren Grundlage Bakterien ihre Enzymlevel regulieren und einstellen. Darüber hinaus werden in diesem Kapitel die für diese Arbeit relevanten und verwendeten Methoden besprochen. In Kapitel 2 werden eine Reihe von Experimenten beschrieben, die bestätigen, dass CRISPRi eine zuverlässige Methode ist, um den Metabolismus in E. coli spezifisch zu perturbieren. Außerdem werden die Vorteile von einem genomisch integriertem CRISPRi-System gezeigt, das dazu verwendet werden kann die Expression von essentiellen Genen induzierbar zu reprimieren. Die Induzierbarkeit und Spezifität konnten durch ein Wachstumsscreening von 100 Stämmen und Proteom-Analysen belegt werden. In Kapitel 3 wird dargestellt, wie das im vorherigen Kapitel beschriebene CRISPRi- System verwendet wurde, um den Metabolismus systematisch zu perturbieren und zu untersuchen. Zunächst wurde das Wachstum von Stämmen in einer gepoolten CRISPRi-Library, welche alle Gene im zentralen Stoffwechsel von E. coli beinhaltete, mittels Next-Generation Sequencing verfolgt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Enzyme im zentralen Metabolismus in höheren Mengen von der Zelle hergestellt werden, als es für die Aufrechterhaltung des Wachstums nötig wäre. Es wurden 30 CRISPRi Stämme mit Hilfe von Metabolomics und Proteomics genauer untersucht, um die zelluläre Antwort auf niedrigere Enzymlevel zu studieren. Hierbei konnte festgestellt werden, dass das Metabolom die Störung von Enzymleveln auf zwei unterschiedliche Wege puffern kann. Zunächst erhöhen Metabolite die Aktivität von Enzymen, um optimales Wachstum zu gewährleisten, und erst später aktivieren sie genregulatorische Feedback-Mechanismen, um perturbierte Stoffwechselwege spezifisch hochzuregulieren. In Kapitel 4 wird geschildert, wie eine alternative Methode, nämlich das Wachstum unter verschiedenen Bedingungen, genutzt wurde, um den Metabolismus zu perturbieren und anschließend die metabolische Antwort zu bestimmen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass in exponentiell wachsenden Zellen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen die Konzentrationen von Schlüsselbausteinen, wie Aminosäuren und Nukleotiden, stabil gehalten werden. Diese Daten wurden zudem mit einem passenden, bereits publizierten Proteomics Datensatz verglichen und es konnte gezeigt werden, dass Metabolitkonzentrationen, im Gegensatz zu Proteinkonzentrationen, unabhängig von Wachstumseffekten sind.