Charaterization AOR Biosynthesis Mo/W-Cofactor https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2020/0478/cover.png Biologie Biosynthese Mo/W-Cofaktor Oxidoreduktase ths Prof. Dr. Heider Johann Heider, Johann (Prof. Dr.) https://doi.org/10.17192/z2020.0478 Life sciences Biowissenschaften, Biologie Tungsten-dependent Aldehyde Oxidoreductase (AOR): Catalytic Properties and Maturation German Tungstoenzymes are abundant among Archaea and Bacteria. The best-characterized are enzymes from Archaea. This thesis presents the characterization of a tungsten-containing aldehyde oxidoreductase (AOR) from a mesophilic bacterium for the first time. AOR from Aromatoleum aromaticum EbN1 forms a heterohexamer of three subunits in a a2b2g2 conformation. It shows a broad substrate spectrum with benzaldehyde and phenylacetaldehyde as the best tested substrates. The activity was measured with benzylviologen and NAD as well. AOR shows stability in cell extracts under oxygen exposure and pure enzyme still shows activity after hours. In contrast, AORs from Archaea lose their activity under oxygen exposure in a few minutes. Usually the AOR was purified from cells of an A. aromaticum mutant which lacks the phenylacetaldehyde dehydrogenase (Pdh) and overproduce the AOR under nitrate reducing conditions with phenylalanine as sole carbon source. As alternative, recombinantly produced AOR was purified from Aromatoleum evansii KB740 cells by affinity chromatography. The ligation of the transition metal to the cofactor is an important step in maturation of molybdenum and tungsten enzymes. With moeA1, moeA2 and moeA3 three putative maturation factors are coded in the genome, which are related to the ligation of the metal to the pterine cofactor. All three gene products were recombinantly produced in E. coli and biochemically characterized. Additionally, the MoeA2 protein was structural analyzed. The protein MoeA2 forms a dimer and shows affinity to molybdate and tungstate as well. MoeA1 do not form a dimer and do not show affinity to W or Mo. The shorter MoeA3 forms a dimer and, based on sequence analysis, MoeA3 appears to be a putative ADP ribose pyrophosphatase. Complementation studies with different E. coli deletion mutants of genes, which are involved in the cofactor maturation, show that corresponding synthetic enzymes from A. aromaticum rescue the pterine cofactor biosynthetic pathway and recover activity of the molybdenum-dependent formate dehydrogenase H (FdhH). Aldehyd Tungstoenzym Fachbereich Biologie Charakterisierung AOR Wolframenzyme sind in den Domänen der Archaea und Bacteria zahlreich vertreten. Gerade archaeelle Enzyme sind intensiv untersucht worden. In dieser Arbeit wird erstmals eine bakterielle wolframabhängige Aldehyd-Oxidoreduktase (AOR) aus einem mesophilen Bakterium charakterisiert. Bei der AOR aus Aromatoleum aromaticum EbN1 handelt es sich um ein Heterohexamer aus drei Untereinheiten mit einer a2b2g2-Konformation. Die AOR besitzt ein breites Substrat-Spektrum mit Benzaldehyd und Phenylacetaldehyd mit den höchsten ermittelten Aktivitäten unter den getesteten Substraten. Die Aktivität kann sowohl mit Benzylviologen als auch mit NAD gemessen werden. Bei Sauerstoff-Exposition bleibt die AOR in Zellextrakten für einen Tag stabil und auch in angereicherter Form besteht sie einige Stunden. Dagegen werden Vertreter dieser Enzymfamilie aus Archaea schon nach wenigen Minuten Exposition an der Luft inaktiviert. Die Produktion der AOR erfolgte in der Regel in einer A. aromaticum-Mutante, die mit Phenylalanin als C-Quelle unter anaeroben Bedingungen kultiviert wurde. In dieser Mutante wurde das Gen für Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase (Pdh) deletiert, einem Enzym was im anaeroben Abbau von Phenylalanin involviert ist. Mit der Etablierung einer heterologen Expression in Aromatoleum evansii KB740 wurde die AOR erstmals rekombinant synthetisiert und mittels Affinitätschromatographie angereichert. Ein wichtiger Schritt in der Maturation von Molybdän- und Wolframenzymen ist die Insertion des Übergangsmetalls in den Cofaktor. Im Genom von A. aromaticum sind mit moeA1, moeA2 und moeA3 drei Gene für putative Maturationsfaktoren vorhanden, die für die Ligation von Molybdän bzw. Wolfram an den Pterin-Cofaktor verantwortlich sein können. Alle drei Genprodukte wurden rekombinant in E. coli produziert und charakterisiert. Im Fall von MoeA2 wurde neben der Charakterisierung der Bindungsaffinitäten auch eine Struktur bestimmt. MoeA2 bildet ein Dimer und besitzt Bindungsaffinität zu Molybdat und Wolframat. Hingegen bildet das rekombinant produzierte MoeA1 kein Dimer und die Untersuchung der Bindungsaffinitäten konnte noch nicht abgeschlossen werden. Das dimere Protein MoeA3 scheint aufgrund fehlender Sequenzmotive und von Sequenzanalysen zu den ADP-Ribose-Pyrophosphatasen zu gehören. Diese Familie ist an der Regeneration von NAD beteiligt. In Komplementationsversuchen mit E. coli-Mutanten, in denen verschiedene Gene für Synthese-Enzyme des Cofaktors deletiert sind, zeigten verschiedene Synthese-Enzyme aus A. aromaticum, dass sie die Biosynthese des Cofaktors widerherstellen, was anhand der Aktivität des Molybdänenzyms Formiat-Dehydrogenase H (FdhH) gezeigt wurde. Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg doctoralThesis opus:9342 Molybdän-Cofaktor 2020-08-26 135 application/pdf Philipps-Universität Marburg monograph Wolfram-Cofaktor Wolframenzym urn:nbn:de:hebis:04-z2020-04781 2020 Arndt, Fabian Arndt Fabian 2020-09-09 Wolframabhängige Aldehyd-Oxidoreduktase (AOR): Katalytische Eigenschaften und Maturation 2020-09-09