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Wolframabhängige Aldehyd-Oxidoreduktase (AOR): Katalytische Eigenschaften und Maturation
Wolframenzyme sind in den Domänen der Archaea und Bacteria zahlreich vertreten. Gerade archaeelle Enzyme sind intensiv untersucht worden. In dieser Arbeit wird erstmals eine bakterielle wolframabhängige Aldehyd-Oxidoreduktase (AOR) aus einem mesophilen Bakterium charakterisiert. Bei der AOR aus Arom...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2020
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Wolframenzyme sind in den Domänen der Archaea und Bacteria zahlreich vertreten. Gerade archaeelle Enzyme sind intensiv untersucht worden. In dieser Arbeit wird erstmals eine bakterielle wolframabhängige Aldehyd-Oxidoreduktase (AOR) aus einem mesophilen Bakterium charakterisiert. Bei der AOR aus Aromatoleum aromaticum EbN1 handelt es sich um ein Heterohexamer aus drei Untereinheiten mit einer a2b2g2-Konformation. Die AOR besitzt ein breites Substrat-Spektrum mit Benzaldehyd und Phenylacetaldehyd mit den höchsten ermittelten Aktivitäten unter den getesteten Substraten. Die Aktivität kann sowohl mit Benzylviologen als auch mit NAD gemessen werden. Bei Sauerstoff-Exposition bleibt die AOR in Zellextrakten für einen Tag stabil und auch in angereicherter Form besteht sie einige Stunden. Dagegen werden Vertreter dieser Enzymfamilie aus Archaea schon nach wenigen Minuten Exposition an der Luft inaktiviert. Die Produktion der AOR erfolgte in der Regel in einer A. aromaticum-Mutante, die mit Phenylalanin als C-Quelle unter anaeroben Bedingungen kultiviert wurde. In dieser Mutante wurde das Gen für Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase (Pdh) deletiert, einem Enzym was im anaeroben Abbau von Phenylalanin involviert ist. Mit der Etablierung einer heterologen Expression in Aromatoleum evansii KB740 wurde die AOR erstmals rekombinant synthetisiert und mittels Affinitätschromatographie angereichert.
Ein wichtiger Schritt in der Maturation von Molybdän- und Wolframenzymen ist die Insertion des Übergangsmetalls in den Cofaktor. Im Genom von A. aromaticum sind mit moeA1, moeA2 und moeA3 drei Gene für putative Maturationsfaktoren vorhanden, die für die Ligation von Molybdän bzw. Wolfram an den Pterin-Cofaktor verantwortlich sein können. Alle drei Genprodukte wurden rekombinant in E. coli produziert und charakterisiert. Im Fall von MoeA2 wurde neben der Charakterisierung der Bindungsaffinitäten auch eine Struktur bestimmt. MoeA2 bildet ein Dimer und besitzt Bindungsaffinität zu Molybdat und Wolframat. Hingegen bildet das rekombinant produzierte MoeA1 kein Dimer und die Untersuchung der Bindungsaffinitäten konnte noch nicht abgeschlossen werden. Das dimere Protein MoeA3 scheint aufgrund fehlender Sequenzmotive und von Sequenzanalysen zu den ADP-Ribose-Pyrophosphatasen zu gehören. Diese Familie ist an der Regeneration von NAD beteiligt. In Komplementationsversuchen mit E. coli-Mutanten, in denen verschiedene Gene für Synthese-Enzyme des Cofaktors deletiert sind, zeigten verschiedene Synthese-Enzyme aus A. aromaticum, dass sie die Biosynthese des Cofaktors widerherstellen, was anhand der Aktivität des Molybdänenzyms Formiat-Dehydrogenase H (FdhH) gezeigt wurde. |
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| Umfang: | 135 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2020.0478 |