The Power of Fragments: FBLD approach to investigate protein structures

Fragments are small chemical entities with the extraordinary advantage of belonging to a wide variety of functional groups able to explore various chemical spaces, penetrate small protein pockets and allow the mapping of various protein binding sites. Nowadays, fragment-based lead discovery (FBLD) i...

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Main Author: Magari, Francesca
Contributors: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
Subjects:
TLN
EP
Online Access:PDF Full Text
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Table of Contents: Fragmente sind kleine organische Moluküle mit einer großen zahl funktioneller Gruppen, die in der Lage sind, verschiedene chemische Räume zu erforschen, in kleine Proteintaschen einzudringen und Proteinbindungsstellen zu finden. Heutzutage ist die Fragment-basierte Leitstrukturentwicklung(FBLD) die Methode der Wahl, um Bindungsstelle in Proteienen zu suchen und spielt eine immer wichtigere Rolle in der Medikamentenentwicklung. Daher ist es notwendig, eine universell einsetzbare Fragmentbibliothek zu haben. In unserer Gruppe wurde eine 96-Fragment-Bibliothek an acht Protein-Targets validiert, die in einem Gemeinschaftsprojekt zwischen der HZB MX-Gruppe am BESSY II (AG Weiss) und dem Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Marburg (AG Klebe) entwickelt wurde (Part I). Unter den acht validierten Proteinen sind Thermolysin (TLN, Part II) und Trypanosoma cruzi Farnesyl Pyrophosphate Synthase (T. cruzi FPPS, Part III), die im Mittelpunkt der vorliegenden Studie standen. Die 96-Fragment-Bibliothek wurde daher als primäre röntgenkristallographische Screeningmethode zur Suche nach neuartigen chemischen Gerüsten eingesetzt. Allerdings musste vor dem Fragmentscreening ein neues Soaking-Protokoll erstellt werden. Tatsächlich haben die Fragmente im Gegensatz zum typischen TLN-Inhibitor in der Regel keine ausreichende Affinität, um das Autoproteolyseprodukt Val-Lys-Dipeptid, das das aktive Zentrum von TLN besetzt, allein zu verdrängen. Die Proteinkristalle wurden daher in einer Isopropanol-Lösung inkubiert, die in der Lage ist, das Dipeptid zu verdrängen, und anschließend gegen die Fragmentbibliothek gescreent, was zu sieben kristallographischen Fragmenthits führte. Im Gegensatz zu TLN, das üblicherweise als Modellprotein verwendet wird, ist T. cruzi FPPS ein Schlüsselenzym im Mevalonatweg beteiligt und für die Sterolproduktion unerlässlich ist. T. cruziund T. brucei-Parasiten verursachen die Chagas-Krankheit (CD) bzw. die humane afrikanische Trypanosomiasis (HAT). Die Hemmung von FPPS bei diesen Spezies ist daher ein gültiges Ziel zur Bekämpfung dieser beiden Tropenkrankheiten. Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich zunächst auf die Optimierung der Stabilität von Proteinproben in Lösung unter Verwendung verschiedener Techniken wie dem Thermal shift-Assay (TSA) und der Lichtstreuung (LS). Anschließend wurde einKristallisations- und Soaking-Protokoll erstellt, bevor ein kristallographisches Fragmentscreening der oben erwähnten 96-Fragment-Bibliothek durchgeführt wurde. Darüber hinaus wurde auch die Rolle des Magnesium-Ions als Kofaktor des Enzyms aufgeklärt, entweder allein oder im Komplex mitIsopentenylpyrophosphat (IPP) oder Bisphosphonaten (BPs). Basierend auf der Entdeckung einer neuen allosterischen Tasche in humanem FPPS durch Jahnke et al. wurde angenommen, dass eine ähnliche Tasche auch in der Spezies Trypanosoma vorhanden ist, die daher Gegenstand der vorliegenden Arbeit war. Das Fragment-Screening-Projekt ergab drei kristallographische Hits, von denen einer in die allosterische Tasche bindet, während die beiden anderen in einer neuen Tasche binden, deren Funktion noch unbekannt ist. Sie können als gute Kandidaten für das Design einer neuen Serie von Leitstrukturen dienen. Neben der 96-Fragment-Bibliothek wurden weitere Reihen von Verbindungen mit Fragment-Größe gegen Endothiapepsin (EP, Part IV) und verschiedene humane Carboanhydrase-Isoformen (hCA, Part V) gescreent. Insbesondere wurde eine Reihe von Tetrazol-Verbindungen kristallographisch gegen EP gescreent, um eine neue Pipeline für die schnelle Entwicklung neuer Aspartyl-Protease-Inhibitoren mit einem Verankerungsansatz zu validieren. Die Hydrazideinheit wurde hier als Fragment-Verankerung gewählt, die in der Lage ist, an die katalytische Dyade im aktiven Zentrum des EP zu binden. Zusätzlich zur Röntgenkristallographie, die in der vorliegenden Arbeit die dominierende Screeningmethode war, wurde eine Reihe von parasubstituiertem Benzolsulfonamiden gegen verschiedene hCAs Isoformen mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) gescreent. Nach Gaspari et al. hängt die Assoziationskinetik der Bindung von hCAII von der Art des Substituenten ab, den das Benzolsulfonamidgerüst trägt. Speziell wird die Assoziationsrate kon durch die Bildung eines hydrophoben Kontakts bestimmt, dessen Bildung mit der vergrößerten Oberfläche der Liganden begüntstigt wird. Dieser Befund wurde auch in der vorliegenden Studie bestätigt. Es scheint jedoch, dass mehr als ein Merkmal zu den Trends bei kon und koff beiträgt. Darüber hinaus zeigte hCAXII im Gegensatz zu hCAII eine schnellere Dissoziationsrate durch die Verlängerung der para-Alkylkette, wahrscheinlich aufgrund der höheren Oberflächenhydrophilie. Die Beschaffenheit der Oberfläche um das aktive Zentrum von hCAs spielt daher eine wichtige Rolle für die Bindungskinetik. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Fragmente mächtige Moleküle sind, die in der Lage sind, neue Proteintaschen zu erforschen und zu entdecken, um zu potenteren Leitverbindungen entwickelt zu werden, und sie werden oft als Ausgangspunkt für verschiedene Screening-Methoden im FBLD verwendet.