Kurz, Michael Kurz Michael FRET ths Prof. Dr. Bünemann Moritz Bünemann, Moritz (Prof. Dr.) GPCR Thromboxan-Rezeptor FRET thromboxane receptor Philipps-Universität Marburg prostanoid receptors 2020-05-25 Fachbereich Pharmazie Daltroban Prostanoid-Rezeptoren 2020-03-26 Pharmakologie und Toxikologie 2020 Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg 154 application/pdf Pharmakologie und Spannungsabhängigkeit ausgewählter Prostanoid-Rezeptoren Pharmacology + therapeutics, prescription drugs Pharmakologie, Therapeutik https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2020/0126/cover.png urn:nbn:de:hebis:04-z2020-01269 GPCR sensors Daltroban Spannungsempfindlichkeit GPCRs opus:9075 GPCR-Sensoren monograph 2020-05-25 German G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Familie transmembranärer Rezeptoren im menschlichen Genom dar. 34% der 2017 von der FDA zugelassenen Wirkstoffe haben einen GPCR als Zielstruktur, weshalb diese Rezeptorgruppe im Fokus der pharmakologischen Forschung steht (Hauser et al., 2017). GPCRs als integrale Membranproteine sind einem starken elektrischen Feld ausgesetzt, das natürlichen Schwankungen unterliegt. Vor mittlerweile über 15 Jahren konnte erstmals für Vertreter dieser Gruppe gezeigt werden, dass die Agonist-induzierte Rezeptoraktivität durch Änderungen des Membranpotentials (VM) moduliert wurde (Ben-Chaim et al., 2003). Obwohl seitdem bereits einige Zeit vergangen ist und an diesem Thema intensiv geforscht wurde, konnten viele sich aus dieser Entdeckung ergebende Fragen noch nicht oder nur teilweise beantwortet werden. So ist bis heute keine allgemein gültige Erklärung zu dem zugrundeliegenden Mechanismus der Spannungsabhängigkeit von GPCRs beschrieben worden. Mittlerweile wurden unterschiedliche Gruppen von GPCRs auf ihre Spanungsabhängigkeit untersucht. Eine Gruppe mit einer weiten Verbreitung im menschlichen Körper, über die vor dieser Studie noch wenig unter diesem Aspekt bekannt war, ist die Gruppe der Prostanoid-Rezeptoren. Der Startpunkt für diese Studie war eine Untersuchung an Megakaryozyten die eine Aktivierung endogener Thromboxan-Rezeptoren (TP-Rezeptoren) in Anwesenheit eines Agonisten bei Depolarisation nahe legte (Martinez-Pinna et al., 2005). Aufgrund der fehlenden Linearität der angewandten Messung von Calciumspiegeln zur Rezeptor-Aktivität, konnte weder eine qualitative noch eine quantitative Untersuchung des Spannungseffektes erfolgen. Wir verwendeten in dieser Arbeit FRET-Biosensoren, die direkter die TP-Rezeptor-Aktivität wiedergaben und somit eine Charakterisierung des Spannungseffektes ermöglichten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine FRET-basierter TP-Rezeptor-Konformations-Sensor kloniert. Die eigentliche Untersuchung der Spannungsabhängigkeit erfolgte mit einer Kombination aus FRET-Messung als Maß für die Rezeptor-Aktivität und gleichzeitiger Patch-Clamp Messung zur Kontrolle der Membranspannung. Hierbei zeigte sich eine robuste Spannungsabhängigkeit des TP-Rezeptors sowohl auf Rezeptorebene, als auch auf Ebene der nachgeschalteten Signalübertragung. Die TP-Rezeptor-Aktivität verdoppelte sich bei Depolarisation von -90 mV auf +60 mV in Gegenwart von U46619, einem stabilen Analogon von Prostaglandin H2. Der für den TP-Rezeptor ermittelte halbmaximale Spannungseffekt V0,5 betrug 46 mV, was innerhalb des physiologischen Bereichs von VM lag. Weiterhin konnten wir zeigen, dass Spannungseffekt sich im Wesentlichen auf die Affinität des TP-Rezeptor für U46619 auswirkte. So konnten wir unter anderem beobachten, dass der EC50 für U46619 bei -90 mV im Vergleich zu +60 mV ungefähr 4,5-fach links verschoben war und das gleiche Maximum aufwies. Wir haben den Spannungseffekt auf den TP-Rezeptor, aktiviert mit verschieden substituierten Prostanoid-Derivaten, die jeweils Modifikationen an verschiedenen Stellen des Moleküls trugen, getestet. Alle getesteten Liganden zeigten eine Aktivierung bei Depolarisation, was auf eine eher globale Änderung der TP-Rezeptor-Konformation durch Depolarisation hindeutet. Dazu passen unser Befund, dass keine von uns durchgeführten Mutationen, an Stellen die für die Ligandenbindung des TP-Rezeptors wichtig waren, zu einer Änderung Spannungsabhängigkeit des TP-Rezeptors führten. Folglich ergaben sich keine Hinweise auf eine spezifische Modulation der Rezeptor Liganden Interaktion durch Spannungsänderung. Weiterhin konnten wir zeigen, dass der Bereich und die Stärke der Spannungsabhängigkeit durch R2957.40, eine Aminosäure, die sich in Agonistenbindetasche befand, eingeschränkt wurde. Die Modulation der Liganden-induzierten Rezeptor-Aktivität durch VM war nicht auf den TP-Rezeptor beschränkt, da der mit U46619 aktivierte Prostaglandin F-Rezeptor (FP-Rezeptor) und der mit Iloprost aktivierte Prostaglandin E2-Rezeptor-Subtyp 3 (EP3-Rezeptor) eine ähnliche Reaktion auf die Depolarisation zeigten wie der mit U46619 aktivierte TP-Rezeptor. IP-Rezeptor aktiviert mit Iloprost zeigte hingegen keine nachweisbare Spannungsabhängigkeit. Der Unterschied in der Spannungsabhängigkeit konnte nicht auf einzelne unterschiedlich geladene Aminosäuren zurückgeführt werden, weshalb ein komplexerer Unterschied als Grund für die unterschiedliche Spannungsabhängigkeit anzunehmen ist. Im Rahmen dieser Studie wurde auch der PAR1 mit dem besonders sensitiven Gα13-p115-FRET-Interaktions-Assay untersucht, wobei sich herausstellte, dass der PAR1 aktiviert mit Thrombin keinen Spannungseffekt aufwies. Auf der Suche nach einer Liganden-spezifischen Spannungsabhängigkeit wurde Daltroban, ein TP-Rezeptor Antagonist, für den es Hinweise auf einen Partialagonismus gab, untersucht. Es zeigte sich zu unserem Erstaunen, dass Daltroban in hohen Konzentrationen vom Antagonisten zum Partialagonisten wurde, der den TP-Rezeptor transient aktivierte. Aufgrund dieses bemerkenswerten Befundes wurde der beobachtete Daltroban Effekt weiter untersucht. Hierbei zeigte sich, dass der TP-Rezeptor nach Daltroban-Gabe eine reduzierte Aktivierbarkeit aufwies, wobei unklar blieb, ob Daltroban (pseudo )irreversibel am Rezeptor band. Für den partialagonistischen Effekt spielten Kontakte von Daltroban mit der orthosterischen Bindestelle eine Rolle. Zur Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung von Daltroban, wurden verschiedene Daltroban-Derivate getestet. Der zugrundeliegende Mechanismus blieb unklar und wird Gegenstand zukünftiger Forschung sein. Weiterhin wurden in dieser Arbeit eine systematische Herangehensweise entwickelt, um FRET-basierte GPCR-Rezeptor-Sensoren zu klonieren, da diese für zukünftige direkte Untersuchungen der Qualität und Quantität des Spannungseffektes auf die Liganden-induzierte GPCR-Aktivität von großem Wert sein können. So wurden in dieser Arbeit erfolgreich FRET-basierte GPCR-Rezeptor-Sensoren für IP-Rezeptor, FP-Rezeptor und ETB-Rezeptor kloniert. Pharmacology and voltage-dependence of selected prostanoid receptors https://doi.org/10.17192/z2020.0126 GPCR doctoralThesis G-protein coupled receptors (GPCRs) comprise the largest family of transmembrane receptors in the human genome. Thirty-four percent of the drugs approved by the FDA in 2017 have a GPCR as their target, which is why this receptor group is in focus of pharmacological research (Hauser et al., 2017). GPCRs as integral membrane proteins are exposed to a strong electrical field that is subject to natural fluctuations. It is now over 15 years ago, that for the first time the agonist-induced receptor activity modulated by changes in membrane potential (VM) could be shown for a member of this group (Ben-Chaim et al., 2003). Although some time has passed since then and intensive research has been carried out on this topic, many questions arising from this discovery have not yet been answered or only partially. To date, no generally valid explanation of the underlying mechanism of the voltage dependence of GPCRs has been described. In the meantime, different groups of GPCRs have been examined on their voltage dependence. A group with a wide distribution in the human body, with only limited information accessible concerning this aspect before this study was carried out, is the prostanoid receptor group. The starting point for this study was an investigation of megakaryocytes that suggested activation of endogenous thromboxane receptors (TP receptors) in the presence of an agonist upon depolarization (Martinez-Pinna et al., 2005). Due to the lack of linearity in the measurement of calcium levels used for receptor activity, neither a qualitative nor a quantitative analysis of the voltage effect could be carried out. We used in FRET biosensors, which directly reflected the TP receptor activity and thus made it possible to characterize the voltage effect. In the context of this work, a FRET-based TP receptor conformation sensor was cloned. The actual investigation of the voltage dependence was carried out with a combination of FRET measurement as a measure of the receptor activity and simultaneous patch-clamp measurement to control the membrane potential. We observed a robust voltage dependence of the TP receptor both at the receptor level and on the downstream signal level. TP receptor activity doubled upon depolarization from -90 mV to +60 mV in the presence of U46619, a stable analog of prostaglandin H2. The half-maximal voltage effect V0.5 determined for the TP receptor was -46 mV, which was within the physiological range of VM. We were also able to show that the voltage effect mainly modulated the affinity of the TP receptor for U46619. Beside other findings pointing in this direction, we observed that the EC50 for U46619 at -90 mV was left shifted about 4.5 times compared to the EC50 at +60 mV and both curves had the same maximum. We tested the voltage effect on the TP receptor, activated with differently substituted prostanoid derivatives, each of which carried modifications at different positions around the molecule. All ligands tested showed activation upon depolarization, which indicated a more global change in the TP receptor conformation due to depolarization. Our finding fits with the observation that none of the point mutations we performed, in positions important for ligand binding of the TP receptor, led to a change in the voltage dependence of the TP receptor. Consequently, there was no evidence for a specific modulation of the receptor-ligand interaction by changes in membrane potential. Furthermore, we were able to show that the range and strength of the voltage dependence was restricted by R2957.40, an amino acid that is situated in the agonist pocket. The modulation of ligand-induced receptor activity by VM was not limited to the TP receptor, since the prostaglandin F receptor (FP receptor) activated with U46619 and the prostaglandin E2 receptor - subtype 3 (EP3 receptor ) activated with Iloprost showed a similar reaction to the depolarization as observed for the TP receptor activated with U46619. In contrast, IP receptor activated with Iloprost showed no detectable voltage dependence. The difference in voltage dependence could not be attributed to individual charged amino acids, which is why a more complex difference can be assumed as the reason for the different voltage dependence. Within this study, the PAR1 was also examined with the particularly sensitive Gα13-p115-FRET interaction Assay, here it turned out, that the PAR1 activated with thrombin was not modulated by changes in VM. While searching for a ligand-specific voltage dependence, Daltroban, a TP receptor antagonist, for which there was evidence of partial agonism, was examined. To our surprise, it turned out that at high concentrations Daltroban converted from an antagonist to partial agonist, which transiently activated the TP receptor. Because of these remarkable findings, the observed Daltroban effect was further investigated. It was shown that the TP receptor had a reduced capability to be activated, after administration of Daltroban, whereby it remained unclear whether Daltroban bound (pseudo-) irreversibly to the receptor. Contacts between Daltroban and the orthosteric binding site played a role in the partial agonistic effect. Different Daltroban derivatives were tested to investigate the structure-activity relationship of Daltroban. However, the underlying mechanism has remained unclear and will be the subject of future research. Furthermore, a systematic approach to clone FRET-based GPCR receptor sensors was developed in this work, since these sensors can be of great value for future direct studies of the quality and quantity of the voltage effect on the ligand-induced GPCR activity. In this work, FRET-based GPCR receptor sensors for IP receptor, FP receptor and ETB receptor were successfully cloned. voltage sensitivity GPCRs