Thermodynamic, Kinetic and Crystallographic Investigations of Benzenesulfonamides as Ligands of Human Carbonic Anhydrase II

The data presented here show that different geometries of para-alkyl substituents of a benzenesulfonamide scaffold can have a significant influence on the thermodynamic and kinetic binding parameters and suggest, that the fine-tuning of the ligand geometry to match the geometry of the active site le...

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Main Author: Glöckner, Steffen
Contributors: Klebe, Gerhard Prof. Dr. (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Table of Contents: Die hierin vorgestellten Daten zeigen, dass verschiedene Geometrien eines para-Alkylsubstituenten eines Benzolsulfonamidgerüsts einen deutlichen Einfluss auf die thermodynamischen und kinetischen Bindungsparameter haben können und deuten darauf hin, dass die Feinabstimmung der Komplementarität der Molekülgeometrie des Liganden auf die des aktiven Zentrums des Proteins zu einer verlangsamten Dissoziationskinetik des Protein-Ligand Komplexes und somit zu einer längeren Blockade des aktiven Zentrums führen kann. Zusätzlich wurde festgestellt, dass die mit isothermer Titrationskalorimetrie extrahierten kinetischen Daten mit Daten aus Experimenten mit Oberflächenplasmonenresonanz für eine Teilmenge von Verbindungen korrelieren, trotz eines bisher nicht zu erklärenden Unterschieds von einer Größenordnung. Darüber hinaus zeigte die Untersuchung von fluorierten Benzolsulfonamidliganden komplexe strukturthermodynamische und strukturkinetische Beziehungen, die hierin nicht vollständig aufgeklärt werden konnten, aber darauf hindeuten, dass die selektive Fluorierung einer meta-Position des aromatischen Rings hohe Assoziations- als auch niedrige Dissoziationsraten begünstigt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass hochgradiger fluorierte Analoga nicht notwendigerweise einen Vorteil für das thermodynamische oder kinetische Bindungsprofil oder die Affinität selbst haben. Darüber hinaus deuten strukturell ähnliche Liganden mit nur einem para-Substituenten, aber unterschiedlichen Aciditäten darauf hin, dass eine erhöhte Acidität des Liganden erhöhte Assoziationsraten begünstigt. Ein neues Messprotokoll für mikrokalorimetrische Messungen wurde auf seine Präzision hin analysiert und mit anderen möglichen Messprotokollen verglichen und zeigte, dass es sich am besten für die zuverlässige gleichzeitige Ermittlung von thermodynamischen und kinetischen Daten mittels Mikrokalorimetrie eignet. Die mikrokalorimetrische Untersuchung eines bereits bekannten und vermeintlich sehr potenten Carboanhydraseinhibitors zeigte ein unerwartetes zweistufiges Bindungsverhalten, das eine reine 2 : 1 Bindung von Inhibitor und Protein jedoch ausschließt. Zeitabhängige Experimente lassen den Schluss zu, dass der Bindungsvorgang zwischen Protein und Ligand zu einem thermodynamisch und einem kinetisch bevorzugten Komplex führt. Die Untersuchung eines chiralen heterocyclischen Carboanhydraseinhibitors konnte nicht abschließend klären, ob auch das kristallografisch scheinbar nicht bindende Enantiomer auch inhibitorische Wirkung zeigt. Mikrokalorimetrische Untersuchungen weisen jedoch darauf hin, dass unter den experimentellen Bedingungen Racemisierung Auftritt, was die Klärung der ursprünglichen Frage deutlich erschwert. Das Tränken von Carboanhydrasekristallen in Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen eines Liganden zeigte, dass die Besetzung einer zweiten Bindestelle zu schwach war, um kristallographisch modelliert zu werden, was die angestrebte Untersuchung der Konzentrationsabhängigkeit der Besetzung unmöglich machte. Konzentrationsunterschiede sorgten jedoch für unterschiedliche Besetzungen des aktiven Zentrums. Ein kristallografisches Modell, das auf Neutronenbeugungsdaten der humanen Carboanhydrase II im Komplex mit Saccharin basiert, wurde nicht erhalten. Es wurde jedoch versucht, den Protonierungszustand von Saccharin an der aktiven Stelle des Enzyms mit Hilfe von hochaufgelösten Röntgenbeugungsdaten durch experimentelle Phasierung zu beurteilen. Die Fortsetzung eines Fragment-Screenings zeigte die Bindung weiterer Kleinmoleküle in Carboanhydrasekristallen. Eine Analyse mit dem Pan-Dataset Density Analysis Programm lässt darauf schließen, dass Elektronendichtekarten stark von der Zeit der Tränkung des Kristalls abhängig sind.