Immuno Magnetic Thermosensitive Liposomes For Cancer Therapy

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Verkapselung des Arzneistoffs Doxorubicin (DOX) in immunparamagnetische thermosensitive Liposomen. DOX ist das häufigste Chemotherapeutikum zur Behandlung einer Vielzahl von Karzinomen. Jedoch besitzt der reine Arzneistoff eine hohe Zytotoxizität und erfordert somit ein gezieltes und biokompatibles Trägersystem. Das einleitende Kapitel dieser Arbeit umfasst Konzepte, Modalitäten und Funktionalitäten des Projektes. Es findet zunächst eine detaillierte Beschreibung des Zelltyps (dreifach-negativer Brustkrebs) statt. Des Weiteren wird die Bedeutung von liposomalem DOX erklärt und der aktuelle Forschungsstand aufgezeigt. Die Bedeutung der Modifikation zur Erzielung der thermosensitiven Eigenschaften und die Vorgehensweise zur Co-Verkapselung mit Gd-Chelat um paramagnetische Eigenschaften zu erreichen wird ebenfalls behandelt. Zudem wird im ersten Teil die Oberflächenmodifikation mit ADAM8-Antikörper beschrieben, was zu einem verbesserten Targeting führt. Der zweite Teil der Arbeit umfasst die verschiedenen Materialien und Methoden, die in der vorliegende Arbeit zum Einsatz kamen. Die Herstellung der Liposomen LipTS, LipTS-GD, LipTS-GD-CY, LipTS-GD-CY-MAB und die Beladung von DOX unter Verwendung eines Ammoniumsulfatgradienten wurden detailliert beschrieben. Das erste Kapitel des Ergebnisteils behandelt die physikalisch-chemische Charakterisierung mittels dynamischer Lichtstreuung und Laser-Doppler-Velocimetrie, welche eine gleichmäßige monodisperse Verteilung der Liposomen bestätigte. Diese Eigenschaften erleichtern die Annäherung der Liposomen an die Zielkrebszellen. Der Einfluss der Lipidzusammensetzung der Liposomen, der Co-Verkapselung von Gd-Chelat und der Oberflächenmodifikation der Liposomen wurde entsprechend bewertet und beschrieben. Größe und Struktur der einzelnen liposomalen Formulierungen wurden mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie und Transmission-selektronenmikroskopie bestimmt. Die morphologische Untersuchung der Liposomen bestätigte eine Übereinstimmung mit den Größen, die durch dynamische Lichtstreuung erhalten wurden. Temperaturabhängige AFM-Bilder zeigten eine intakte Liposomenstruktur bei 37 °C, wohingegen eine Erhitzung durch UHF-MRI, zu einem Lipidfilm führte, der auf die Zerstörung der Lipiddoppelschicht hinwies. Des Weiteren zeigten TEM-Bilder die morphologischen Eigenschaften der Liposomen und gaben einen genaueren Hinweis wie sich Gd-Chelat innerhalb der Liposomen anlagert. Liposomen mit Gd-Chelat zeigten gut getrennte Vesikel, was darauf hindeutete, dass sich Gd-Chelat in der Lipiddoppelschicht der Liposomen einlagert. Gd wurde in den hydrophilen Kern der Liposomen vereingekapselt, wohingegen das Gd-chelat in die Lipidmembran ragt. Durch dynamische Differenzkalorimetrie und temperaturabhängige Arzneimittelfreisetzung konnte die Wärmeempfindlichkeit der Liposomen bestimmt werden. Liposomen zeigten einen Beginn der Phasenübergangstemperatur bei etwa 38 °C, was ebenfalls unter UHF-MRT-Exposition erreicht werden kann. Das Maximum dieser Temperatur lag im Fall von LipTS-GD und LipTS-GD-CY-MAB bei 42 und 40 °C. Eine „Proof-of-Concept-Studie“ für die thermosensitiven Eigenschaften der Liposomen sowie ein zeitabhängiges DOX-Freisetzungsprofil bei Hyperthermie wurde erstellt. Gd-Chelat ist sowohl in LipTS-GD als auch in LipTS-GD-CY-MAB enthalten und führte daher zu paramagnetischen Eigenschaften dieser Liposomen. Dies ermöglichte die UHF-MRT-vermittelte DOX-Freisetzung sowie die Diagnostik solider Tumore und metastasierender Zellen. Die Änderung der Relaxationsrate R1 der Liposomen wurde vor und nach dem Erhitzen über Tm (T> Tm) quantifiziert. Die Relaxivität der Liposomen wurde aus der berechneten Steigung der Relaxationsrate gegen die Gd-Konzentration erhalten. Bemerkenswerterweise erhöhten sich die Relaxationsrate und die Relaxivität nach dem Erhitzen der Liposomen über Tm (T> Tm), was darauf hinweist, dass sich die Liposomen öffneten, Gd-Chelat freisetzten und der Austausch von Wassermolekülen schneller und praktikabler wurde. Toxizitätsstudien beschreiben die verschiedenen Mechanismen für die induzierte DOX-Toxizität. Die stärkere zytotoxische Wirkung bei erhöhten Temperaturen zeigt eine thermisch induzierte Toxizität, d.h. es kam zu einer Freisetzung von DOX aus den Liposomen bei erhöhter Temperatur. Die Überlebensrate der Zellen bei 37 °C deutet darauf hin, dass die Liposomen bei normalen physiologischen Temperaturen intakt waren. Unter UHF-MRT-Behandlung wurde eine Zelltoxizität aufgrund einer erhöhten Temperatur erreicht. Die Verfolgung der zellulären Aufnahme der Liposomen unter UHF-MRT fand mit Hilfe der konfokaler Lasermikroskopie statt. Ein Anstieg der Fluoreszenzintensität wurde nach UHF-MRT-Exposition beobachtet. Die Untersuchung des Aufnahmewegs zeigte, dass die Mehrzahl der Liposomen hauptsächlich durch Clathrin-vermittelte Endozytose aufgenommen wurden. Darüber hinaus wurden die Liposomen mit Anti-ADAM8-Antikörper (MAB 1031) modifiziert um ein gezieltes Targeting zu ermöglichen. Die zellulären Bindungsfähigkeiten der oberflächenmodifizierten und nicht-modifizierten Liposomen wurden auf Zellen getestet, die eine ADAM8-Überexpression hatten, sowie auf ADAM8-Knockdown-Zellen. Oberflächenmodifizierte Liposomen zeigten einen signifikanten Anstieg der Bindungsfähigkeiten, was auf ein signifikantes Targeting gegen Zellen hinweist, die ADAM8 auf ihrer Oberfläche überexprimieren. Zusätzlich konnten Zellen mit Knockdown-ADAM8 keine signifikante Menge an modifizierten Liposomen binden. Die Bewertung der Biokompatibilität der Liposomen wurde unter Verwendung eines Hämolysetests und einer aktivierten Thromboplastinzeit (aPTT) bestimmt. Liposomen zeigten ein vernachlässigbares hämolytisches Potential. Ebenso zeigen aPTT-Studien, dass Liposomen die Blutgerinnung nicht stören. Hämokompatibilitätsstudien können helfen, die Korrelation zwischen in vitro und in vivo zu verstehen. Zur bewertung der systemischen Biokompatibilität wurde das in ovo Chorioallantoismembranmodell verwendet, das einen alternativen Tierversuch darstellt. Im Toxizitätstest wurden Liposomen intravenös in die Hühnerembryonen injiziert. Die Liposomen zeigten eine vernachlässigbar schädliche Wirkung auf die Entwicklung des Embryos. Während freies DOX einen schädlichen Effekt auf das Überleben der Hühnerembryonen hatte, dies bestätigt das verbesserte Sicherheitsprofil der Liposomen im Vergleich zu freiem DOX. LipTS-GD-CY-MAB wurden am Eierentwicklungstag 11 in das Gefäßsystem des Hühnerembryos injiziert und unter UHF-MRT gescannt, um die magnetischen Eigenschaften der Liposomen in einem biologischen System mit T2-gewichteten Bildern (3D) zu bewerten. Die liposomale Formulierung hatte erkennbare magnetische Eigenschaften unter UHF-MRT und das Küken überlebte den Scan. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass immunomagnetische wärmeempfindliche Liposomen eine neuartige Arzneiform zur TNBC-Behandlung darstellen könnte. Sie dient sowohl zur Diagnose als auch zur Therapie von soliden und metastasierenden Tumore ohne Nebenwirkungen auf das Nachbargewebe zu haben. Das weitere Vorgehen besteht darin einen Tumor im CAM-Modell zu etablieren, das selektive Targeting der Liposomen zu visualisieren und mittels Fluoreszenz sowie UHF-MRT zu quantifizieren. Ebenso müssen die Liposomen an Mäusen als dreifach-negatives Brustkrebsmodell im Xenograft-Verfahren getestet werden, um weitere Wirkungen von DOX-LipTS-GD-CY-MAB zu untersuchen. Zum einen sollen die Liposomen hinsichtlich ihrer Zielbarkeit und ihrer selektiven Bindung bewertet werden. Andererseits wird die ausgelöste Freisetzung von DOX aus den Liposomen nach UHF-MRT-Exposition und die therapeutische Wirkung von DOX-Liposomen auf den Tumor bewertet.