Production and analysis of synthetic Cascade variants

Table of Contents: CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR assoziiert) ist ein adaptives Immunsystem in Archaeen und Bakterien, das fremdes genetisches Material mit Hilfe von Ribonukleoprotein-Komplexen erkennt und zerstört. Diese Komplexe bestehen aus einer CRISPR RNA (crRNA) und Cas Proteinen. CRISPR-Cas Systeme sind in zwei Hauptklassen und mehrere Typen unterteilt, abhängig von den beteiligten Cas Proteinen. In Typ I Systemen sucht ein Komplex namens Cascade (CRISPR associated complex for antiviral defence) nach eingedrungener viraler DNA während einer Folgeinfektion und bindet die zu der eingebauten crRNA komplementäre Sequenz. Anschließend wird die Nuklease/Helikase Cas3 rekrutiert, welche die virale DNA degradiert (Interferenz). Das Typ I System wird in mehrere Subtypen unterteilt, die Unterschiede im Aufbau von Cascade vorweisen. Im Fokus dieser Arbeit steht eine minimale Cascade-Variante aus Shewanella putrefaciens CN-32. Im Vergleich zur gut untersuchten Typ I-E Cascade aus Escherichia coli fehlen in diesem Komplex zwei Untereinheiten, die gewöhnlicher Weise für die Zielerkennung benötigt werden. Dennoch ist der Komplex aktiv. Rekombinante I-Fv Cascade wurde bereits aus E. coli aufgereinigt und es war möglich, den Komplex zu modifizieren, indem das Rückgrat entweder verlängert oder verkürzt wurde. Dadurch wurden synthetische Varianten mit veränderter Protein-Stöchiometrie erzeugt. In der vorliegenden Arbeit wurde I-Fv Cascade weiter mit in vitro Methoden untersucht. So wurde die Bindung von Ziel-DNA beobachtet und die 3D Struktur zeigt, dass strukturelle Veränderungen im Komplex die fehlenden Untereinheiten ersetzen, möglicherweise um viralen Anti-CRISPR Proteinen zu entgehen. Die Nuklease/Helikase dieses Systems, Cas2/3fv, ist eine Fusion des Cas3 Proteins mit dem Interferenz-unabhängigen Protein Cas2. Ein unabhängiges Cas3fv ohne Cas2 Untereinheit wurde aufgereinigt und in vitro Assays zeigten, dass dieses Protein sowohl freie ssDNA als auch Cascadegebundene Substrate degradiert. Das komplette Cas2/3fv Protein bildet einen Komplex mit dem Protein Cas1 und zeigt eine reduzierte Aktivität gegenüber freier ssDNA, möglicherweise als Regulationsmechanismus zur Vermeidung von unspezifischer Aktivität. Weiterhin wurde ein Prozess namens „RNA wrapping“ etabliert. Synthetische Cascade-Komplexe wurden erzeugt, in denen die grundlegende RNA-Bindung des charakteristischen Cas7fv RückgratProteins auf eine ausgewählte RNA gelenkt wird. Diese spezifische Komplexbildung kann in vivo durch eine Repeat-Sequenz der crRNA stromaufwärts der Zielsequenz und durch Bindung des Cas5fv Proteins initiiert werden. Die erzeugten Komplexe beinhalten die ersten 100 nt der markierten RNA, die anschließend isoliert werden kann. Innerhalb der Komplexe ist die RNA stabilisiert und geschützt vor Degradation durch RNasen. Komplexbildung kann außerdem genutzt werden, um ReportergenTranskripte stillzulegen. Zusätzlich wurden erste Hinweise geliefert, dass das Rückgrat der synthetischen Komplexe durch Fusion mit weiteren Reporterproteinen modifiziert werden kann.