Novel lipoparticles for the synergistic chemo-photodynamic therapy of the cancer cells

Das Hauptthema der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines neuartigen Nanocarrier-systems, das zwei verschiedene Therapieansätze zur Krebsbehandlung vereint. Ein solcher Nanocarrier ist dem herkömmlichen Drug Delivery System überlegen, da er verschiedene Ansätze (z.B. Chemotherapie und photodynamische Therapie) innerhalb eines Trägersystems kombiniert. In dieser Arbeit lag der Fokus auf Lipid umhüllte, biologisch abbaubare Nanopartikel, die als „Lipopartikel“ bezeichnet werden. Hierbei ist es möglich, zwei hydrophobe Arzneistoffe in getrennten Bereichen des Trägersystems zu verkapseln: ein Chemotherapeutikum (Pirarubicin, THP) im Nanopartikelkern und ein photoaktiver Stoff (Temoporfin, mTHPC) in der Lipid-Doppelschicht. Ein solches System erhöht nicht nur die therapeutische Wirksamkeit, die Blutzirkulationszeit und die Bioverfügbarkeit der Arzneimittel, sondern reduziert auch den frühzeitigen Austritt des Arzneistoffes sowie Nebenwirkungen auf andere Gewebe. In der Einleitung der Arbeit werden die Grundprinzipien und der detaillierte Mechanismus der photodynamischen Therapie dargestellt. Das Eigenschaftenprofil wie auch deren Optimierung solcher photoaktiven Stoffe, der sogenannten „Photosensitizer“, standen hier im Vordergrund der Diskussion. Im Anschluss erfolgte eine systematische Präsentation nanoskaliger „drug delivery“ Systeme, einschließlich Liposomen, polymerer Nanopartikel und Lipid-Polymer-Hybrid-Nanopartikel. Verschiedene Methoden zur Herstellung der modernen Lipopartikel wurden ebenfalls dargestellt und diskutiert. Der experimentelle Teil der Dissertation umfasst die Herstellung mTHPC-beladener Liposomen, THP-beladener Nanopartikel und Lipid umhüllter Polymernanopartikel. Die Charakterisierung der hergestellten parenteralen Formulierungen erfolgte mit Hilfe von physikalisch-chemischen Methoden, in vitro, in ovo, in vivo sowie mit toxikologischen Biokompatibilitätsstudien. Der Ergebnisteil beschreibt ausführlich die verwendeten Methoden und Analyse der Verkapselung von mTHPC, dem verwendeten potenten Photosensitizer der 2. Generation, in Liposomen. Zu diesem Zweck wurde ein breites Spektrum an Lipidkombinationen getestet und mit physikalisch-chemischen Methoden einschließlich Größenverteilung, Zetapotenzial sowie deren Verkapselungseffizienz untersucht. Durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Gefrier-Transmissionselektronenmikroskopie konnte die Teilchengröße wie auch deren Oberflächenmorphologie analysiert werden. Die Ergebnisse dieser Studien bestätigten die Ergebnisse der PCS-Messungen. Weitere Untersuchungen wie die quantitative Bewertung der während der biologischen Untersuchungen entstandenen reaktiven Sauerstoffspezies sowie die Wirkung der in Zellkultur durchgeführten photodynamischen Therapie, bei verschiedenen Wellenlängen und Lichtstärken, wurden diskutiert. Um die unethische Nutzung von Versuchstieren zu minimieren, erfolgte die Untersuchung der gezielten antivaskulären (antiangiogenese Therapie) photodynamischen Therapie an dem chorioallantoischen Membranmodell (CAM, in ovo), das eine Alternative zum in vivo Modell darstellt. Die Aufnahme der Wirkstoffträger in die Zellen erfolgte mit Hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und verdeutlichte eine effektive zelluläre Aufnahme in den perinukleären Bereich. 94 Das folgende Kapitel des Ergebnisteils beschäftigt sich mit der Verkapselung von THP in PLGA-Nanopartikel. Zwei verschiedene Größen von Nanopartikeln (200nm und 400nm) wurden hergestellt, um eine vergleichende Bewertung der Größe der Nanopartikel und des Polydispersitätsindex auf das Zellüberleben zu erhalten. Diese Daten konnten mittels dynamischer Lichtstreuung bzw. MTT-Assay erhalten werden. Die in vitro Freisetzung des Arzneistoffes unter simulierten Bedingungen ergab ein zweiphasiges Freisetzungsprofiel, mit einer anfänglichen Burst-Freisetzungsphase, gefolgt von einer über die folgenden Tage anhaltenden kontinuierlichen Freisetzung. Die THP-Nanopartikel mit geringerer Größe (200 nm) zeigten dabei eine höhere Wirkstofffreisetzung pro Zeiteinheit im Vergleich zu 400 nm großen THP Nanopartikeln, was als eine Folge der größeren verfügbaren Oberfläche für die Wirkstoffdiffusion diskutiert werden kann. Basierend auf den Voruntersuchungen wurden im nächsten Kapitel die beiden leistungsstärksten Liposomen zu einem einzigen Liposom mit der Zusammensetzung DPPC/DPPG/mPEG-DPPE5000 kombiniert. Diese Liposomen sind anschließend zur Beschichtung der 200nm großen THP-Nanopartikel verwendet worden. Diese wurden eingehend physikalisch-chemisch charakterisiert. Die Lipopartikelgröße nimmt um etwa 4-5 nm im Vergleich zu unbeschichteten Nanopartikeln zu, was auch die oberflächenmorphologischen Studien mit AFM und TEM bestätigten. Die Bestimmung der höheren therapeutischen Wirksamkeit der Lipopartikel durch Zytotoxizitätsstudien wurde in vitro betätigt. Der Nachweis der erhöhten Produktion reaktiver Sauerstoffspezies erfolgte ebenfalls. Die Einzelzellgelelektrophorese (Comet-Assay) gab keinerlei Hinweise auf eine Genotoxizität der Lipopartikel. Die Untersuchung der Stabilität der Lipopartikel fand unter simulierten physiologischen Bedingungen (60% Serum, PBS 7,4) statt und zeigte eine geringe Vergrößerung des Partikeldurchmessers durch das Vorhandensein einer Proteinkorona. Durch Biokompatibilitätsstudien war es möglich, die Verträglichkeit der Lipopartikel mit Blutkomponenten zu validieren. Die Bestimmung der aktivierten Teilthromboplastinzeit und Erythrozytenaggregationstests bestätigten die Verträglichkeit und Biokompatibilität der Lipopartikel. Anschließend konnte die in vivo Toxizität der Lipidpartikel an BALB/c-Mäusen stattfinden. Es wurden keine signifikanten Veränderungen im viszeralen Index der Mäuse und in den Serum-Biomarkern beobachtet. Die Gewebehistopathologie zeigte ebenfalls keine signifikanten Veränderungen. Auf der Grundlage all dieser Ergebnisse kann der Schluss gezogen werden, dass es möglich ist, solche neuartigen Nanocarriersystems für die gleichzeitige Abgabe verschiedener Arzneistoffe an Krebszellen mit minimaler Toxizität prinzipiell einzusetzen. Die zukünftige Erstellung des pharmakokinetischen Profils einschließlich der in vivo Biodistribution und die Überprüfung der Effektivität der Lipopartikel an in vivo Tumormodellen können als kritisches Bindeglied für präklinische Studien dienen. Auch durch eine Kopplung von Liganden (z.B. Antikörpern, Aptameren etc.) kann eine weitere Steigerung der Effizienz erreicht werden.