Chemical Biology Applications of Photoresponsive DNA-Binding Agents

This thesis presents the synthesis of novel photoresponsive DNA-binding agents as well as their application for both visualization and control of biological processes. In addition, the implementation of an innovative course to transfer the interdisciplinary research culture of chemical biology to ed...

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Main Author: Heinrich, Benedikt
Contributors: Vázquez, Olalla (Jun. Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
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In der vorliegenden Thesis werden die Synthese innovativer photoregulierbarer DNA-bindender Verbindungen sowie deren Anwendung zur Visualisierung und Steuerung biologischer Prozesse vorgestellt. Darüber hinaus wird über die Implementierung eines neuartigen Kurses zur Übertragung der interdisziplinären Forschungskultur der Chemischen Biologie auf die Lehre berichtet. Diese kumulative Dissertation besteht hauptsächlich aus vier Kapiteln, die sich jeweils mit veröffentlichten oder in Revision stehenden Artikeln befassen. Zudem umfasst die Arbeit eine Einleitung, eine Motivation und je Kapitel einen Ausblick. Der erste Artikel wurde in der Angewandten Chemie International Edition veröffentlicht und beschreibt die Entwicklung einer neuen tiefrot fluoreszierenden DNA-bindenden Verbindung 6-TramTO-3 als alternatives chemisches Instrument zum Grün-Fluoreszierenden-Protein (GFP) für Interaktionsstudien mit lebenden multiresistenten Krankheitserregern und Wirtszellen. Basierend auf der Grundstruktur des Thiazoloranges (TO) wurde ein neuer Cyaninfarbstoff, 6-TramTO-3, entwickelt, dessen spektroskopische Eigenschaften untersucht wurden. Eine DNA-Bindungsanalyse durch UV-vis-, Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie wurde durchgeführt, um den Bindungsmodus nach Zugabe von DNA zu untersuchen. Konfokale Fluoreszenzmikroskopie, FACS und Wachstumskurvenanalyse mit lebenden E. coli zeigten eine effiziente Färbung von 93% und keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Bakterien. Entscheidend dabei ist, dass 6-TramTO-3 die üblichen Problematiken anderer häufig verwendeter chemischer Fluorophore wie Ethidiumbromid, Carboxyfluorescein-Succinimidylester und SyTO-9, wie geringe Färbungseffizienz und Zytotoxizität ohne genetische Manipulation überwindet. Aufgrund dieser herausragenden Eigenschaften haben wir 6-TramTO-3 im Weiteren mit Antibiotika-sensitiven wie auch multiresistenten Klebsiella pneumoniae-Stämmen getestet. 6-TramTO-3 verlieh beiden Stämme eine hochspezifische rot-fluoreszierende Verschiebung mit 91% und 87% in den 652-671 nm roten Kanal, ohne die Viabilität zu beeinflussen. Als nächstes führten wir Phagozytosetests mit menschlichen Makrophagen durch, wobei erstmalig ein unterschiedliches Wirtsverhalten gezeigt werden konnte. Neben der Veröffentlichung des Fachartikels wurden ein europäisches Patent angemeldet (18174086.1 - 1011) und zahlreiche Kooperationen mit Universitäten, Forschungsinstituten und Unternehmen initiiert, um 6-TramTO-3 in diversen Zusammenhängen anzuwenden. Der zweite Artikel wurde in Organic & Biomolecular Chemistry veröffentlicht und stellt ortho-Tetrafluorazobenzolderivate als DNA-Interkalatoren für die photokontrollierbare Bindung an der DNA und den Nukleosomen durch Bestrahlung mit sichtbarem Licht vor. Dieses ist für biologische Systeme weniger schädlich und daher UV-Licht vorzuziehen, welches für die die Regulierung der bekanntesten photoschaltbaren nukleinsäurebindenden Systeme benötigt wird. Die Einführung einer solchen Einheit in das Grundgerüst des kleine Furchen bindenden Netropsins führt zu einer dynamischen Kontrolle und änderte den Erkennungsmodus. UV-Vis-, HPLC- und NMR-Analyse zeigten die Photoisomerisierung der neuen Verbindungen. Eine DNA-Bindungsanalyse mittels UV-Vis-, Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie ergab einen interkalierenden Bindungsmodus mit Affinitäten im niedrigen nM-Bereich und Unterschieden zwischen den Isomeren. Schließlich wurde die Verwendung des neuen Derivats als lichtkontrollierbare nukleosomenbindende Substanz untersucht. Die bei freier DNA beobachteten unterschiedlichen Bindungsaffinitäten wurden für die nukleosomale DNA bestätigt. Interessanterweise zeigten Elektromobilitäts-Shift-Untersuchungen und dynamische Lichtstreuungsexperimente, dass die trans-Form der Verbindung eine Aufweitung der nukleosomalen DNA induzierte, die zur Entwindung der Nukleosomen führte. Diese Erkenntnisse werden dazu beitragen, eine photochemische Kontrolle einzuführen, um den Weg zur Veränderung von nukleosomenbasierten Prozessen durch Licht zu ebnen. Das dritte Kapitel dieser Arbeit ist ein in Revision stehendes Manuskript im Journal Organic Letters und befasst sich mit einem neuartigen Syntheseansatz der Pyrrol-Imidazol (Py-Im)-DNA-bindende Polyamide auf der Basis von 4-Methyltrityl (Mtt) Festphasenpeptidsynthese (SPPS) zugänglich macht. Üblicherweise werden Py-Im-Polyamid-Haarnadeln durch Boc- und Fmoc-SPPS synthetisiert. Neue Mtt-geschützte Pyrrol- und Imidazol-Bausteine wurden mit höheren Ausbeuten als die entsprechenden Boc- und Fmoc-Analoga synthetisiert. Ihre Anwendung konnte durch die Synthese und Untersuchung eines DNA-bindenden Polyamids unter Einsatz der Mtt-Bausteine erfolgreich gezeigt werden. Unsere Methode ist orthogonal zu Fmoc und ermöglicht die Implementierung basenlabiler Verbindungen und anderer empfindlicher Gruppen in der Py-Im-Polyamidchemie, wodurch neue Polyamidkonjugate erhalten werden können. In einem weiteren Versuch war es bereits möglich, die neuen Bausteine für die Einführung einer photoschaltbaren Verbindung in das Polyamid-Haarnadel-Rückgrat zu verwenden, die die Einführung von dynamischer und räumlicher Kontrolle der sequenzspezifischen DNA-Bindung in biologischen Untersuchungen ermöglicht. Das vierte Kapitel ist ein in bearbeiteter Revision stehendes Manuskript im Journal of Chemical Education, welches einen neuartigen Kurs für Masterstudenten in den Fächern Chemie und Biologie vorstellt, um die vorhandene Lücke zwischen interdisziplinärer Spitzenforschung und der Ausbildung künftiger Wissenschaftler zu schließen. Mit anderen Worten, der Kurs zielte darauf ab, durch die Kombination von Vorlesungen, einem entdeckungsbasierten Forschungslaborkurses und wissenschaftlicher Kommunikation das authentische „Gesamtbild“ der Wissenschaft zu vermitteln. Die Studierenden erlebten die Vorteile von Kollaborationen, verfassten einen kurzen Artikel und wurden bei der Konzeption und Präsentation ihrer eigenen Forschungsvorschläge in der Chemischen Biologie angeleitet. Die Evaluation des Kurses zeigte eindeutig, dass die Lehrveranstaltung kooperative Forschungsbeziehungen zwischen Biologie- und Chemiestudenten fördert, ein einzigartiges und echtes Forschungserlebnis bietet und das Interesse der Studierenden an interdisziplinären Ansätzen und gemeinsamer Arbeit erhöht. Das Kurs- und Bewertungsmaterial wird zugänglich sein, um andere interdisziplinäre Wissenschaftsbereiche zu inspirieren ähnliche Kurse durchzuführen.