https://doi.org/10.17192/z2019.0527 Biologie doctoralThesis Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg transport Import enzymes The stress-protectants and chemical chaperones ectoine and hydroxyectoine: enzymes, importer, exporter and transcriptional regulation Genregulation kompatible Solute Transport monograph Ectoine Import 2020-07-09 https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0527/cover.png Czech, Laura Czech Laura Ectoine import Changes within the external osmotic potential belong to the most ubiquitous stress factors that microbial cells encounter. A large group of Bacteria, but also a few Archaea and unicellular halophilic Eukarya possess the genetic information to produce the compatible solutes and chemical chaperones ectoine and its derivative 5-hydroxyectoine. These compounds are consequently amassed within the cytoplasm to counteract the reduction in turgor pressure resulting from the outflow of water during high extracellular osmolarity. Ectoines are not only major stress protective compounds for microorganisms but their physicochemical attributes and function-preserving features also entailed their industrial production and use in the fields of biotechnology, medicine and cosmetics. Ectoine biosynthesis from the precursor L-aspartate-β-semialdehyde is achieved in a three step enzymatic reaction involving the enzymes: EctB (L- 2,4-diaminobutyrate aminotransferase), EctA (L-2,4-diaminobutyrate acetyltransferase) and the key enzyme EctC (ectoine synthase). Furthermore, a hydroxyl group can be attached to the ectoine molecule by the ectoine hydroxylase (EctD) yielding 5-hydroxyectoine. The underlying biosynthetic genes are mostly encoded in a gene cluster [ectABC(D)] that is controlled by an osmotically responsive promoter. Besides de novo synthesis of the stress protective compounds, they can also be imported from environmental resources through specific osmotically controlled uptake systems. In the following paragraph the research subjects and major results of my PhD thesis will be briefly summarized: • Bioinformatical analysis focusing on the phylogenetic distribution of the genes for ectoine biosynthesis and investigation of their gene neighborhoods • Structural and functional analysis of ectoine/5-hydroxyectoine biosynthetic enzymes o Crystallographic, biochemical and functional analysis of the key enzyme for ectoine biosynthesis EctC led to the postulation of the performed reaction mechanism o Substrate ambiguity of the ectoine hydroxylase (EctD) was exploited for the stereo- and regioselective hydroxylation of the synthetic ectoine derivative homoectoine • Establishment of ectoine/5-hydroxyectoine-producing cell factories o Secretion of the products is independent of the mechanosensitive channels and ectoine import systems in the heterologous producer E. coli • Regulation of the expression of ectoine biosynthetic genes o Detailed molecular and functional analysis of the ect promoter from P. stutzeri A1501 led to the identification of an unusual sigma-70-type promoter and insights into the determinants involved in osmotic regulation of the ect genes o Bioinformatical, crystallographic and functional analysis of the MarR-type regulator EctR from Novosphingobium • Analysis and characterization of transporters present in the gene neighborhood of ectoine biosynthetic gene clusters o Co-transcriptionofnoveltransportersandmechanosensitivechannels o Functional characterization of two novel ectoine transporters with a broad substrate spectrum (EctI) and specificity for ectoines (EctU) o Functional analysis of mechanosensitive channels, that are encoded within ect gene clusters o Identification and characterization of an ectoine/5-hydroxyectoine specific exporter (EctE) Export opus:8872 Export urn:nbn:de:hebis:04-z2019-05270 osmotischer Stress Life sciences Biowissenschaften, Biologie Ectoine osmotischer Stress Die Stressprotektiva und chemischen Chaperone Ectoine und Hydroxyectoine: Enzyme, Importer, Exporter und transkriptionelle Regulation compatible solutes Philipps-Universität Marburg kompatible Solute 2019-11-18 export Fachbereich Biologie Transport Fluktuationen des extrazellulären osmotischen Potentials zählen zu den häufigsten Stressfaktoren für Mikroorganismen. Nicht nur zahlreiche Organismen der Domäne Bacteria, sondern auch einige Archeen und wenige einzellige, halophile Eukaryoten besitzen die genetische Information zur Synthese der kompatiblen Solute und chemischen Chaperone, Ectoin und 5-Hydroxyectoin. Unter hochosmolaren Bedingungen werden diese Substanzen innerhalb des Zytoplasmas angehäuft, um den Ausstrom des Wassers entlang des Konzentrationsgradienten zu verhindern und somit, den essentiellen Turgordruck innerhalb der Zelle aufrecht zu erhalten. Ectoine erfüllen nicht nur wichtige Schutzfunktion für Mikroorganismen, sie besitzen darüber hinaus nützliche physikalisch-chemische und funktions-erhaltende Eigenschaften. Diese Attribute führten zur industriellen Produktion und kommerziellen Verwendung von Ectoinen. Die drei Enzyme EctB (L-2,4-Diaminobutyrat Aminotransferase), EctA (L-2,4-Diaminobutyrat Acetyltransferase) und das Schlüsselenzym EctC (Ectoin Synthase) sind für die Biosynthese von Ectoin aus dem Vorläufer L-Aspartat-β-Semialdehyd verantwortlich. Zusätzlich kann durch die Ectoin Hydroxylase (EctD) eine Hydroxylgruppe eingeführt werden, was zur Entstehung von 5-Hydroxyectoin führt. Die Gene des Ectoin-Biosynthesewegs sind meist in einem Operon kodiert [ectABC(D)], das durch einen osmotisch-induzierbaren Promotor gesteuert wird. Neben der de novo Synthese von Ectoinen, besitzen die meisten Mikroorganismen spezielle Osmolyttransporter, die deren Aufnahme aus der Umwelt ermöglichen. Im Rahmen dieser Dissertation wurden folgende Bereiche untersucht und Ergebnisse erhalten: • Bioinformatische Analysen zur phylogenetischen Verbreitung von Ectoin- Biosynthesegenen und Untersuchung der Genomumgebungen von ect Clustern • Strukturelle und funktionelle Analyse von Enzymen des Ectoin-Biosynthese-Wegs o Kristallographische, biochemische und funktionelle Analyse des Schlüsselenzyms EctC führten zur Postulierung des Reaktionsmechanismus o Die Substratpromiskuität der Ectoin-Hydroxylase (EctD) ermöglichte die stereo- und regio-selektive Hydroxylierung des synthetischen Ectoin-Derivats Homoectoin • Etablierung von Ectoin/5-Hydroxyectoin-produzierenden Zellfabriken o Die Sekretion der Produkte erfolgt unabhängig von mechanosensitiven Kanälen und den Aufnahmesystemen für Ectoine im heterologen Produzenten E. coli • Regulation der Ectoine-Biosynthese-Gene o Detaillierte molekulare und funktionelle Analyse des ect Promotor aus P. stutzeri A1501 identifizierten einen untypischen Sigma-70-abhängigen Promotor und lieferte neue Einblicke in die Determinanten für die osmotische Regulation der ect Gene o Bioinformatische, kristallographische und funktionelle Analyse des MarR-typ Regulators EctR aus Novosphingobium • Untersuchung von Transportern in der Genomumgebung von Ectoin-Biosynthese- Clustern o Co-Transkription neuer Transporter und mechanosensitiver Kanäle o Charakterisierung zwei neuer Ectoin-Transportern mit breitem Substratspektrum (EctI) und hoher Spezifität für Ectoine (EctU) o Funktionelle Analyse von mechanosensitiven Kanälen, die in ect Genclustern kodiert sind o Identifizierung und Charakterisierung eines spezifischen Exporters für Ectoine (EctE) ths Prof. Dr. Bremer Erhard Bremer, Erhard (Prof. Dr.) English gene regulation 2019 osmotic stress 396 application/pdf Genregulation 2020-07-09 Enzyme Enzyme