Understanding and Engineering Metabolic Feedback Regulation of Amino Acid Metabolism in Escherichia coli

Metabolism is the core of what we consider to be a living cell. It covers all chemical reactions that are necessary to break down nutrients and convert them into energy and cellular building blocks for growth. These chemical reactions comprise a large metabolic network that is subject to tight feedb...

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Main Author: Sander, Timur
Contributors: Link, Hannes (Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2019
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Online Access:PDF Full Text
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Stoffwechsel spielt eine zentrale Rolle in allen lebenden Organismen. Die Gesamtheit aller biochemischen Reaktionen gewährleistet den Abbau und Umwandlung von Substraten in Energie und Bausteine für zelluläres Wachstum. Solch biochemische Reaktionen sind in netzwerkartigen Strukturen angeordnet und unterliegen regulatorischen Mechanismen wie der Kontrolle von Enzym Aktivitäten (Allosterische Regulation) und -Abundanzen (Transkriptionelle Regulation). Dennoch ist selbst in Modellorganismen wie Escherichia coli wenig über die globalen Wirkweisen und Interaktionen dieser Regulationsmechanismen bekannt. Das Hauptziel dieser Thesis bestand darin, am Beispiel des Aminosäure Stoffwechsels von E. coli, die Funktion und Relevanz von Regulationsmechanismen für die lebende Zelle zu verstehen. Darüber hinaus sollte das gewonnene Wissen darauf verwendet werden, bakterielle Zellen für die biotechnologische Produktion von wertvollen Aminosäuren wie L-Arginin zu modifizieren. In Kapitel 1 wurde eine Zusammenstellung von sieben E. coli Punktmutanten generiert, in welchen die allosterische Inhibierung von jeweils einem Aminosäure Biosyntheseweg entfernt wurde. Damit sollte die bisher unklare Funktion von allosterischer End-Produkt Inhibierung in vivo demonstriert werden. Mit Hilfe von globalen Metabolit- und Proteomdaten, sowie Messungen des biosynthetischen Flusses konnte gezeigt werden, dass Zellen durch allosterische Inhibierung Enzymreserven generieren. Solche Enzymreserven werden durch eine sensitive Interaktion von allosterischer und transkriptioneller Regulation eingestellt. Weiterhin konnte durch eine mathematische Modellierung in Kombination mit CRISPRi-Experimenten nachgewiesen werden, dass Enzymreserven Zellen robuster gegen genetische Störungen machen. In Kapitel 2 wurde untersucht, ob das Wachstum eines biotechnologischen Arginin Produzenten durch verschiedene Level transkriptioneller Regulation verbessert werden kann. Dafür wurde der Transkriptionsfaktor ArgR mittels CRISPRi auf verschiedene Level titriert und mit einer ArgR Deletion verglichen. Durch die Titration von ArgR konnte die Wachstumsrate eines Überproduktionsstammes verdoppelt werden ohne dabei die Arginin Produktionsrate und den Titer negativ zu beeinflussen. Metabolit und Protein Messungen ergaben, dass der Wachstumsdefizit der Deletions-Mutante durch Limitierungen in der Pyrimidin Biosynthese entsteht. Diese Limitierungen entstehen wiederum durch Ungleichgewichte von Enzymen an metabolischen Schnittpunkten zwischen Arginin und Pyrimidin Biosynthesewegen. In Kapitel 3 wurden die molekularen Mechanismen in Reaktion auf genetische Perturbationen charakterisiert. Dafür wurden die finalen Experimente aus Kapitel 1 aufgegriffen und drei verschiedene Aminosäure Produktionswege durch CRISPRi perturbiert und die transkriptionelle Reaktion mittels Fluoreszenz-Reporterplasmiden und Protein Messungen untersucht. Die Experimente ergaben, dass Zellen auf Störungen der Gen-Expression reagieren, indem sie die gesamte Expression des jeweiligen Biosyntheseweges anheben um einer Enzymlimitierung entgegenzuwirken. Anhand von Durchflusszytometry und dynamischen Metabolit Messungen konnte beobachtet werden, dass allosterische Mutanten ohne Enzymreserven eine heterogene und sensitivere transkriptionelle Reaktion auf genetische Störungen zeigen. In Kapitel 4 sollte untersucht werden, ob Zellen Aminosäure Abbauwege als Überlaufventil nutzen um End-produkt Homöostase zu gewährleisten. In dynamischen Experimenten mit Substratwechseln von Glukose zu Galaktose, zeigten Mutanten mit hochregulierten Abbauwegen einen Wachstumsvorteil. Mit Hilfe von dynamischen Metabolit Messungen konnte gezeigt werden, dass ein Überfluss an Arginin in den jeweiligen Abbauweg umgeleitet wird. Ein solcher Mechanismus könnte die Robustheit der allosterischen Mutanten in dynamischen Experimenten erklären.