APOE isoform-specific effects in isogenic human iPSC-derived neural cells

Die Alzheimer-Erkrankung (AE) ist nach wie vor die Hauptursache für Demenz bei älteren Menschen, für die es immer noch keine Heilung gibt. Die Bemühungen in der Medikamentenentwicklung konzentrierten sich weitgehend auf die Behandlung von neuronalen Pathologien, die relativ spät in der Erkrankung auftreten. Der größte Teil dieser Forschung wird in neuronenfokussierten Nagetier-Modellen durchgeführt, welche menschliche Gene überexprimieren, die bekanntermaßen die familiäre AE verursachen (wie APP, PSEN1). Die familiäre Form der AE betrifft jedoch nur etwa 5% der Patienten, im Gegensatz zur sporadischen AE, die die restlichen Fälle ausmacht. Die Ineffektivität bestehender Therapieansätze, die vor allem darauf abzielen, den Spiegel von Aβ im Gehirn zu senken, hat sowohl die von Aβ dominierte als auch die neurozentrische Sichtweise der Krankheit in Frage gestellt. Aufgrund ihres komplexen Zusammenspiels mit Neuronen wird der Rolle von Astrozyten bei neurodegenerativen Prozessen eine größere Bedeutung zugemessen. Der stärkste genetische Risikofaktor für die sporadische AE ist das E4-Allel des APOE-Gens (Corder et al., 1993). Das APOE-Protein hat 3 Isoformen: APOE2 (protektiv), APOE3 (wildtypisch) und APOE4 (pathogen) und wird hauptsächlich von Astrozyten produziert. Die meisten APOE4-bezogenen Dysfunktionen im AE-Gehirn wurden bisher vor allem angesichts von Aβ-basierten Prozessen, die sich im Alter anhäufen oder vor dem Hintergrund abnormaler Expression von APOE in Neuronen, bedingt durch zellulären Stress, aufgrund von Alterungsprozessen oder anderen Faktoren, beschrieben. Es fehlt jedoch an Erkenntnissen über die zellautonomen Wirkungen von APOE4 in Astrozyten. Um die Krankheit frühestmöglich zu erkennen, muss der Fokus zudem stärker auf das Studium von Dysfunktionen gelegt werden, von denen bekannt ist, dass sie bei prädisponierten Personen frühzeitig auftreten. Dazu gehören metabolische Dysfunktionen (Reiman et al., 2004) und endozytische Anomalien (Cataldo et al., 2000). Auch die Entwicklung besser auf den Menschen ausgerichteter Krankheitsmodelle ist dringend notwendig, um Artefakte zu vermeiden, die durch artspezifische Unterschiede entstehen. Daher ist das Ziel dieser Studie, ein isogenes, vom menschlichen Patienten abgeleitetes neurales Zellmodell zu entwickeln, um APOE4-isoformspezifische Effekte in Neuronen und Astrozyten zu untersuchen. Der erste Schritt zu diesem Ziel war die Generierung einer Reihe von iPS-Zellen, die aus menschlichen APOE4-Trägern und Nicht-Trägern gewonnen wurden. iPSZ wurden dann hinsichtlich ihrer Pluripotenz und chromosomalen Integrität charakterisiert. Um den APOE4/4-Genotyp einer patientenabgeleiteten iPSZ-Linie zu APOE3/3 zu konvertieren, wurden Genome-editing Protokolle für eine präzise homologieorientierte Reparatur (HR) optimiert. Das iPSZ-Feld leidet unter einem Mangel an effizienten Protokollen für CRISPR/Cas9 Ribonukleoprotein-vermittelte HR. Daher wurden optimierte Protokolle für die zelluläre Transfektion der notwendigen editing Komponenten, eine hohe Rate an HR, zelluläre Selektion mittels FACS und klonale Isolierung für iPSZ entwickelt. Unter Verwendung dieser Protokolle wurde eine isogene APOE3/3 iPSC-Linie aus einer APOE4/4 AE-Patientenlinie entwickelt. Die Verwendung von isogenen Kontrollen, die sich nur an einem einzigen genomischen Ort unterscheiden, ist wichtig, wenn man eine polygene Erkrankung wie AE untersucht. Dadurch kann sicher gestellt werden, dass marginale Phänotypen nicht durch Individuums bedingte Variabilität verloren gehen. Das Paar isogener Linien wurde dann zu kortikalen Neuronen differenziert. Die Charakterisierung der Neuronen mit kortikalen Markern ergab, dass iPSZ beider Genotypen ähnliche neuronale Populationen hervorbrachten. Typische AE-bezogene Phänotypen wurden an diesen Neuronen untersucht. Im Vergleich zu APOE3/3 zeigten APOE4/4-Neuronen eine somatodendritische Fehllokalisierung des phosphorylierten Tau und einen erhöhten Zelltod als Reaktion auf oxidativen Stress. Es gab keinen signifikanten Unterschied im Verhältnis Aβ42/40 oder der Größe von Endosomen und Lysosomen zwischen den Genotypen. Die Behandlung von APOE4/4-Neuronen mit APOE4/4 Astrozyten-konditioniertem Medium führte jedoch zu einem Anstieg des Verhältnisses Aβ42/40 sowie zu einer Vergrößerung von Endosom und Lysosom. Als nächstes, um den Beitrag der Astrozyten zur APOE4-assoziierten AE-Pathologie zu untersuchen, wurden die isogenen Linien zu Astrozyten differenziert. Die Astrozyten wurden durch gängige astrozytische Marker und funktionelle Untersuchungen charakterisiert. Die Astrozyten zeigten APOE Expression und Sekretion und waren in der Lage, Glutamat aufzunehmen, Kalziumtransienten als Reaktion auf Glutamat und ATP hervorzurufen und die Chemokin-Sekretion durch Exposition von TNFα zu erhöhen. Im Vergleich zu APOE3/3 Astrozyten weisen APOE4/4 Astrozyten eine Endosomen- und Lysosomenvergrößerung sowie eine Verringerung der glykolytischen Kapazität, der basalen Atmung und der ATP-Produktion auf. Dies ging einher mit einer Reduktion der Expression mitochondrialer Komplexproteine und einem Anstieg der Produktion von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies. Zusammenfassend beschreibt diese Studie die Erzeugung und Charakterisierung iPSZ-abgeleiteter isogener, physiologisch relevanter Neurone und Astrozyten, die für sporadische AE-Modellierungsstudien verwendet werden können. Mit Hilfe dieser Zellen konnten frühe pathologische Prozesse in AE-Astrozyten, wie metabolische und endolysosomale Defizite die in dieser Form bisher nicht bekannt waren, gezeigt werden. Die für das Genome-editing und die Zell-Differenzierung entwickelten Protokolle können zukünftig genutzt werden, um Modelle für andere Krankheiten mit einer eindeutigen genetischen Komponente zu entwickeln.