Characterization of Ebola Virus VP30 Phosphorylation with a Phosphospecific Antibody

Das Ebolavirus gehört zur Familie der Filoviridae, die ein nicht-segementiertes RNA-Genom in negativer Orientierung besitzen. Da das Virus hochpathogen ist und bei Infektion von Menschen eine schwere, oft tödlich verlaufende Krankheit verursacht, wird der Erreger der biologischen Risikogruppe 4 zugeordnet. Replikation und Transkription des viralen Genoms werden durch Proteine des viralen Nukleokapsidkomplexes unterstützt, welcher aus dem RNA-Genom sowie den viralen Proteinen NP, VP24, L, VP35 und VP30 besteht. Während für die Replikation des viralen Genoms NP, VP35 und L ausreichend sind, wird für die Transkription individueller Gene zusätzlich ein funktionstüchtiges VP30 benötigt. Vorangegangene Studien zeigten, dass eine extensive Serin-Phosphorylierung des VP30 zu einer Inhibierung der Transkription führt. In unseren Studien konnten wir nun zeigen, dass die Phosphorylierung von zwei Serin-Resten, genauer gesagt an Serin 29 und Serin 31, sowohl notwendig als auch hinreichend ist, um die Funktion von VP30 als Transkriptionsaktivator herunter zu regulieren. Die Phosphorylierung von VP30 erlaubt auch eine dynamische Interaktion mit anderen viralen Proteinen. Für die primäre Transkription unmittelbar nach der Infektion neuer Zellen muss VP30 phosphorylierbar sein. Wir konnten zeigen, dass die VP30 Phosphorylierung essentiell ist, um den Transport von VP30 mit den Nukleokapsiden zum Ort der primären Transkription sicherzustellen. Mit Hilfe eines phosphospezifischen VP30 Peptidantikörpers, der gegen die Phosphorylierung an Position S29 gerichtet ist, konnten wir darlegen, dass VP30 während der Infektion mit rekombinanten Ebolaviren an Position 29 hauptsächlich dephosphoryliert ist. Während der rekombinanten Expression verschiedener Kombinationen der viralen Proteine zeigte sich, dass andere virale Proteine, besonders das Nukleoprotein NP, die Phosphorylierung des VP30 entscheidend beeinflussen. Wir haben erste Hinweise dafür gesammelt, dass VP30 ein Substrat einer Phosphatase ist, die durch NP in die räumliche Nähe von VP30 rekruitert wird. Darüberhinaus konnten wir zeigen, dass VP30 direkt mit einer bisher unbekannten Kinase interagiert, die ein weit verbreitetes R-X-X-S Phosphorylierungsmotiv für VP30 Serin 29 erkennt. Auf Basis dieser Interaktionen werden die VP30-spezifischen Phosphatasen und Kinasen in virale Einschlusskörper rekrutiert, wo beide Enzyme die virale Transkription und Replikation modulieren.