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Analyse der Statin-vermittelten Regulation der PIM1 Kinase in Krebszellen
Die konstitutiv aktive Serin/Threoninkinase PIM1 ist eine prosurvival Kinase, die zum Überleben von Krebszellen beiträgt, indem sie wesentliche Zellprozesse wie Zellzyklus, Zellwachstum, Differenzierung und Apoptose reguliert. Dieses Proto-Onkogen wird in vielen Krebsarten überexprimiert, darunter L...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2019
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Die konstitutiv aktive Serin/Threoninkinase PIM1 ist eine prosurvival Kinase, die zum Überleben von Krebszellen beiträgt, indem sie wesentliche Zellprozesse wie Zellzyklus, Zellwachstum, Differenzierung und Apoptose reguliert. Dieses Proto-Onkogen wird in vielen Krebsarten überexprimiert, darunter Lymphome, Leukämien und solide Tumore der Leber und des Dickdarms. Darüber hinaus kann PIM1 die Bildung von Metastasen induzieren, indem es die Migration von Krebszellen beeinflusst. So sind hohe PIM1 Level oft mit einer schlechten Tumorprognose verbunden. Da PIM1 als Masterregulator vieler Signalwege fungiert und sein Knockout bei Mäusen nur zu einem leicht veränderten Phänotyp führt, stellt es ein vielversprechendes Zielmolekül für die Krebstherapie dar.
Voruntersuchungen haben gezeigt, dass PIM1 durch Statine in Krebszellen herunterreguliert werden kann. Statine fungieren als kompetitive Inhibitoren der HMG-CoA Reduktase, dem Schlüsselenzym des Mevalonatweges. Da dies eine Hemmung der endogenen Cholesterinbiosynthese herbeiführt, wird dieses bereits auf dem Markt erhältliche Medikament zur Senkung des Cholesterinspiegels eingesetzt. Darüber hinaus bewirken Statine eine verringerte Bildung von Isoprenoiden, was eine Reduktion der Membranverankerung von GTPasen wie Ras, Rac und Rho hervorruft. Dies beeinflusst wichtige Signalwege und führt zur Förderung der Apoptose sowie zur Hemmung der Proliferation, Angiogenese, Tumorinvasion und Metastasierung in verschiedenen Tumorarten. Darüber hinaus haben klinische Studien gezeigt, dass das Risiko schädlicher Nebenwirkungen im Vergleich zu den Vorteilen, die sich aus der Statin-Therapie ergeben können, relativ gering zu sein scheint. Aus diesem Grund stellen Statine ein vielversprechendes Medikament zur Tumor-Behandlung dar. Die molekularen Regulationsmechanismen, die durch eine Statin-Behandlung in Krebszellen induziert werden, sind noch nicht vollständig verstanden. Folglich bilden unsere Beobachtungen, dass Statine einen PIM1-Knockdown vermitteln können, die Grundlage für das erste Projekt in dieser Arbeit, in dem die regulatorische Wirkungsweise von Simvastatin auf PIM1 untersucht wurde. Daher wurden verschiedene Analysen auf transkriptioneller, posttranskriptioneller, translationaler und posttranslationaler Ebene in den Krebszelllinien HepG2, LS174T und Skov3 durchgeführt.
Der durch Statin induzierte PIM1-Knockdown scheint das Ergebnis veränderter Regulationsmechanismen zu sein, wie der relativ späte Wirkungseintritt von Simvastatin nach 36 Stunden auf der mRNA Ebene und nach 48 Stunden auf der Proteinebene zeigt. Während die RT-qPCR Experimente jeweils einen ähnlichen Rückgang der Pim-1 mRNA-Spiegel in der Leber- (HepG2) und der Kolon- (LS174T) Karzinom-Zelllinie verdeutlichen, deuten die Western Blot Ergebnisse nach einer Simvastatin-Behandlung darauf hin, dass die Proteinspiegel von PIM1 in HepG2 Zellen signifikant stärker reduziert sind als in LS174T Zellen. Sie lassen zudem erkennen, dass die Simvastatin-vermittelte Hemmung von PIM1 in beiden Zelllinien nicht durch den proteasomalen oder lysosomalen Proteinabbau reguliert wird. Darüber hinaus kann der Statin-bedingte Knockdown von Pim-1 auch auf transkriptioneller Ebene ausgeschlossen werden, wie der Dual-Luciferase-Assay nach der Transfektion von Pim-1-Promoter-Konstrukten in HepG2 Zellen und der Western Blot nach ektopischer Expression von PIM1 in Skov3 Zellen zeigt. Stattdessen lässt das RT-qPCR Experiment zur Inhibition der Transkriptions-Initiation in der Leberkarzinom-Zelllinie eine Regulierung über die posttranskriptionelle Ebene, vermittelt durch den Pim-1 mRNA Abbau, vermuten. Darüber hinaus scheint in den HepG2 und LS174T Zellen der Statin-bedingte Knockdown von PIM1 auf der Translationsebene reguliert zu sein, wie die Untersuchungen zur Hemmung der Translations-Elongation verdeutlichen. Weitere Analysen zeigten, dass der Statin-Effekt auf dieser Ebene in den HepG2 Zellen spezifisch für PIM1 ist, während eine generelle Inhibition der Proteinneusynthese durch Simvastatin in der Dickdarmkarzinom-Zelllinie vorgeschlagen werden kann.
Im zweiten Projekt wurde die Rolle von PIM1 bei der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen analysiert. Dazu wurden Monozyten aus Spenderblut isoliert und in M1-Makrophagen differenziert, die eine Anti-Tumor-Reaktion des Immunsystems auslösen. Um die Funktion von PIM1 als vermeintlichen Regulator der Differenzierung zu untersuchen, wurden die Pim-1 mRNA- und Proteinlevel in den verschiedenen Entwicklungsstadien der Monozyten und Makrophagen detektiert.
Die RT-qPCR Experimente haben hierbei gezeigt, dass die Pim-1 mRNA Spiegel über den gesamten analysierten Zeitraum, von Monozyten bis zur vollständigen Reife der Makrophagen, schwanken. Zu Beginn des Differenzierungsprozesses konnte ein Anstieg der Pim-1 mRNA Spiegel beobachtet werden, welche gegen Ende wieder abnahmen. Die Western Blot Untersuchungen konnten verdeutlichen, dass neben den Pim-1 mRNA Spiegeln auch die Proteinlevel während der Differenzierungsphase der Makrophagen erhöht sind. Dies bestätigt die Annahme, dass PIM1 eine Rolle bei der Regulation der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen spielen könnte. |
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| Umfang: | 156 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2019.0245 |