Identification of genes involved in the biosynthesis of lignans in Linum flavum

Lignane sind phenolische Verbindungen des sekundären Stoffwechsels der Pflanze, die von der Aminosäure Phenylalanin oder Tyrosin abgeleitet sind. Lignane sind im gesamten Pflanzenreich weit verbreitet und haben mehrere pharmazeutisch-medizinische Bedeutungen. Ein Beispiel für eine medizinisch verwendete Substanz ist das Aryltetralin-Lignan Podophyllotoxin (PTOX), das zytotoxische Aktivität aufweist. Es wird zur Behandlung von Genitalwarzen, aber auch zur Herstellung der PTOX-Derivate Etoposid und Teniposid verwendet. Diese Medikamente werden zur Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt. Podophyllum spec. sind derzeit die Hauptquelle für Podophyllotoxin. Aryltetralin-Lignane können jedoch auch in einigen Flachsarten nachgewiesen werden (Linum spec.). Die Biosynthese von Aryltetralin-Lignanen ist in die frühen und späten Schritte unterteilt. Während die frühen Reaktionsschritte nun vollständig identifiziert wurden, sind einige Enzyme und Reaktionen in Bezug auf die späten Schritte nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit werden Untersuchungen zur Biosynthese von Lignanen wie PTOX oder 6-Methoxypodophyllotoxin (MPTOX) in Suspensionskulturen von L. Flavum durchgeführt. Die Rollen von Pinoresinol-Lariciresinol-Reduktase (PLR), Secoisolariciresinoldehydrogenase (SDH), Desoxypodophyllotoxin-6-hydroxylase (DOP6H) und Desoxypodophyllotoxin-7-hydroxylase (DOP7H) sind von besonderem Interesse. Enzym DOP6H und DOP7H wurden bereits in Linum spec. und gehören möglicherweise zur CYP-Familie. Daher ist die Identifizierung von NADPH-Cytochrom-P450-Reduktase (CPR), die für Cytochrom-P450-abhängige Reaktionen unerlässlich ist, auch ein Ziel dieser Arbeit. Zu Beginn wurden die RNA und gDNA aus den Suspensionskulturen von L. flavum isoliert. Von der RNA wurden zwei CPR erfolgreich identifiziert und charakterisiert. Zur Berechnung der scheinbaren Km-Werte wurden Enzymtests mit unterschiedlichen Konzentrationen von NADPH und Cytochrom c durchgeführt. Beide CPR 66401 und 4753 zeigten eine hohe enzymatische Aktivität gegenüber Cytochrom c mit einem Km-Wert von 8,15 µM bzw. 15,6 µM. CPR 66401 zeigte den Km-Wert von 29,6 μM gegenüber NADPH als Elektronendonor und CPR 4753 hatte den Km-Wert von 45,2 μM. Aus den Sequenzen von zwei CPRs wurden jeweils zwei Bindungsstellen für FMN, FAD und NADPH und eine Bindungsstelle für Cytochrom P450 erhalten. Basierend auf den Membranankerregionen am N-Terminus werden CPR 66401 und CPR 4753 gemäß Ro et al. (2002) in Klasse I bzw. II klassifiziert. PLR ist ein bifunktionelles Enzym, das die Bildung von Secoisolariciresinol aus Pinoresinol über Lariciresinol katalysiert. Aus dem Transkriptom von L. flavum wurde ein Contig mit der höchsten Ähnlichkeit mit PLR gefunden. Dieses Contig wurde erfolgreich aus der RNA von Suspensionskulturen von L. flavum isoliert und anschließend als PLR charakterisiert. Das PLR von L. flavum katalysiert die Umwandlung von (+)-Pinoresinol über (+)-Lariciresinol in (-)-Secoisolariciresinol stereospezifisch. PLR zeigte einen Km-Wert für NADPH von 22,4 μM und hat die höchste katalytische Aktivität bei einem pH-Wert von 7 und einem Temperatursbereich von 27 °C bis 33 °C. Um die Rolle der variierenden Größe wichtiger Aminosäuren in der Bindungstasche zu untersuchen, wurden zwei Mutanten von PLR G280Y und Y284G konstruiert. Der Verlust der enzymatischen Aktivität beider Mutanten LfPLR G280Y und Y284G zeigte die entscheidende Rolle von zwei Positionen G280 und Y284 für die katalytische Aktivität dieses Enzyms. Zusätzlich wurden mehrere Kandidaten für CYP und SDH im Transkriptom von L. flavum erhalten. Elf offene Leserahmen (ORF) von CYP und fünf ORF von SDH wurden erfolgreich aus RNA oder gDNA von L. flavum amplifiziert. Sie wurden auch erfolgreich in E. coli und Hefe exprimiert. Die konservierte Domäne für CYP und SDH wird in den Sequenzen der einzelnen Kandidaten beobachtet. Trotzdem zeigten keine rekombinanten Proteine irgendeine Aktivität in Enzymassays. Möglicherweise ist eine posttranslationale Modifikation für diese Enzyme unerlässlich, und Bakterien und Hefe reichen nicht aus, um die erforderlichen Modifikationen durchzuführen. Ein höheres Expressionssystem, zum Beispiel in Pflanzen oder Insekten, könnte eine Lösung für dieses Problem sein. Die Suche nach Kandidaten sollte auch verfeinert werden, um nach anderen Kandidaten für CYP und SDH zu suchen.