A protein complex formed by Ustilago maydis effectors is essential for virulence

Table of Contents: Ustilago maydis ist ein biotropher Brandpilz, der Maisbeulenbrand in Mais verursacht. Bei der Ausbreitung innerhalb einer Pflanze sekretiert U. maydis Effektorproteine um pflanzliche Abwehrreaktionen zu unterdrücken und die Physiologie der Wirtspflanze zu seinem eigenen Vorteil zu manipulieren. Die Funktion der Mehrheit dieser Proteine konnte noch nicht beschrieben werden und deren Wirkung beim Befall bleibt somit bislang ungeklärt. Mittels einer Genexpressionsanalyse konnte eine Reihe von Effektoren bestimmt werden, deren Expression an die biotrophe Phase gekoppelt ist. Eine systematische Deletion dieser Effektoren führte zur Entdeckung dreier Mutanten, die nicht mehr in der Lage waren eine Erkrankung hervorzurufen. Die Mutanten dieser drei Effektoren, namentlich stp2, stp3 und stp4 (Stop nach Penetration), konnten immer noch Appressorien ausbilden und die Pflanzenzelle penetrieren, arretierten dann jedoch in der Maisepidermis. Dieser Stillstand wurde von Abwehrreaktionen der Pflanze begleitet, einschließlich des Absterbens der infizierten Zellen. Ein ähnlicher Phenotyp wurde bereits bei den früher beschriebenen Effektoren stp1 und pep1 beobachtet. Alle fünf Effektoren sind hochkonserviert innerhalb der Brandpilze, was auf eine wesentliche Funktion dieser hindeutet. Mittels konfokaler Mikroskopie, in vivo Studien und in vitro Studien konnte nachgewiesen werden, dass Stp2, Stp3, und Stp4 vom Pilz sekretiert werden, jedoch nicht in das Zytoplasma der Wirtszelle translozieren. Konfokale Mikroskopie mit mCherry-Fusionsstämmen der fünf essentiellen Effektoren zeigte, dass diese ein gesprenkeltes Muster auf der Oberfläche der biotrophen Hyphe bilden. Durch Immunopräzipitation und anschließender massenspektroskopischer Analyse mit jedem der essentiellen Effektoren zeigte sich, dass Stp1, Stp3, Stp4 und Pep1 einen Effektorkomplex bilden. Diese vier Komplexeffektoren zeigten weder eine spezifische Interaktion mit Stp2 noch mit Pflanzenproteinen. Jüngste Experimente legen nahe, dass Stp2 mit mindestens zwei anderen U. maydis Effektoren interagiert, die einen vergleichbaren Deletionsphänotyp wie stp2 haben. Versuche den stp1, stp3, stp4 und pep1 Effektorkomplex mittels einer bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) sichtbar zu machen, wirkte störend auf die Bildung des Komplexes und führte zu einem kompletten Verlust der Virulenz. Die folgende Überexpression von zwei BiFC Fragment getaggten Komplexmitgliedern im Wildtypallel führte zu einem dominant negativen Phenotyp. Hierdurch konnte bewiesen werden, dass nicht nur das Vorhandensein der einzelnen Komplexmitglieder, sondern auch die Komplexbildung selbst für eine erfolgreiche Kolonisierung der Pflanze notwendig ist. Indessen ermöglichte die Nutzung der intakten fluoreszierenden Proteine eine Co-Lokalisation der Komplexmitglieder innerhalb der Sprenkel. Schließlich bestätigten Interaktionsstudien in Saccharomyces cerevisiae die Bildung des Komplexes und demostrierten sogar paarweise Interaktionen und Subkomplexbildungen zwischen den Komplexmitgliedern. Basierend auf diesen Ergebnissen wird vorgeschlagen, dass der Effektorkomplex eine Struktur bildet, dessen Funktion unabdingbar für die Virulenz von U. maydis ist und sich potenziell auch als Ziel für zukünftige Pflanzenschutzmittelentwicklungen eignet.