Regulation of peptidoglycan biosynthesis in Hyphomonas neptunium

Zusammenfassung Die räumliche und zeitliche Regulation der Peptidoglycan-Biosynthese und ihre Rolle für die Zellmorphologie wurde bisher nur in wenigen gut charakterisierten Modellorganismen, wie Escherichia coli, Bacillus subtilis und Caulobacter crescentus untersucht. Diese Bakterien teilen sich entweder durch symmetrische oder asymmetrische Zweiteilung. Um unsere Kenntnisse über die Mechanismen der bakteriellen Morphogenese zu erweitern, haben wir begonnen das dimorphe marine α-Proteobakterium Hyphomonas neptunium zu analysieren und als neuen Modellorganismus zu etablieren. Diese Gram-negative Spezies zeigt ein einzigartiges Vermehrungsverfahren, bei dem eine neue Tochterzelle an der Spitze eines Stiels gebildet wird, der aus dem Zellkörper der Mutterzelle wächst. In vorausgangenen Studien lag unser Hauptfokus auf der Identifikation von Zellwand-synthetisierenden Enzymen und regulatorischen Faktoren, die in die Stiel- und Tochter-zellbiogenese involviert sind. Diese Untersuchungen zeigten, dass die Peptidoglycan-Biosynthese von H. neptunium einen komplexen Prozess darstellt ist, der das Zusammen-spiel vieler verschiedener Faktoren erfordert. Wie die Entstehung der Tochterzelle im Detail funktioniert oder Peptidoglycan remodellierende Enzyme während des Zellzyklus lokalisiert werden, ist bisher noch nicht bekannt. Zu Beginn der Proliferation werden sie am gestielten Pol, später aber in der Tochterzelle benötigt. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit ist die detaillierte Charakterisierung schon bekannter Peptidoglycan-Biosyntheseenzyme. Dies involviert vor allem eine genauere Analyse der hydrolytischen Enzyme, die Peptidoglycan spalten. Wir betrachten hier zwei Klassen von Hydrolasen im Detail, die M23-Endopeptidasen und die Amidasen. Sechs M23-Endopep-tidasen werden im Genom von H. neptunium codiert. In Lokalisations- und Deletionsstudien haben wir sie umfassend analysiert und konnten eine hohe Redundanz der Enzyme zeigen. Sie weisen eine diffuse Verteilung im ganzen Zellkörper auf, was auf eine Funktion bei der Erhaltung der Zellform nahelegt. Weiterhin untersuchten wir die Rolle der einzigen Amidase (AmiC) auf die Zellseparierung und Tochterzellbildung. Eine Deletion des Amidase-Genes amiC veränderte die Morphologie und führte zu einem leicht kettenartigen Phänotyp. Wir konnten zeigen, dass eine der M23-Endopeptidasen (LmdE) als Regulator der Amidase AmiC fungiert. In biochemischen Untersuchungen bewiesen wir eine Bindung und Interaktion von LmdE mit AmiC. LmdE stimuliert die katalytische Aktivität von AmiC und reguliert daher die Peptidoglycan-Hydrolyse. Eine weitere wichtige Komponente in diesem System ist der membranintegrale FtsEX-Komplex. Die Deletion des gesamten Komplexes resultierte in Zellen mit sehr langen und deformierten Stielen. FtsEX spielt wahrscheinlich eine Rolle in der Amidaseregulation, indem es mit LmdE interagiert. Diese Resultate sind ähnlich zwischen γ- und knospenden α-Proteobakterien und deuten auf einen konservierten Mechanismus der Amidaseaktivierung hin. Ein weiteres wichtiges Ziel unserer Arbeit war die Identifikation von neuen Faktoren, die in die Regulierung der Teilung von H. neptunium involviert sind. Daher haben wir angefangen, ein Transposon-Mutagenesesystem zu etablieren, mit dem alle essentiellen Gene identifiziert werden können. Zukünftig werden wir in der Lage sein, unbekannte Faktoren zu untersuchen und ihren Beitrag zur Morphogenese zu beleuchten. Zusammen genommen zeigen diese Resultate tiefen Einblicke in die Mechanismen der Morphogenese in gestielten knospenden Bakterien. Sie stellen eine Plattform bereit für eine eingehende Analyse der regulatorischen Mechanismen, die der räumlichen und zeitlichen Dynamiken der Peptidoglycan-Biosynthese zu Grunde liegen.