Entwicklung eines Westernblot-Testsystems zur Detektion der humanen Transkriptionsfaktoren GATA-3 und T-Bet

Asthma bronchiale ist eine chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege. Das betroffene Patientenkollektiv lässt sich anhand unterschiedlicher Kriterien in verschiedene Phänotypen und Endoypen einteilen. Biomarker sind Grundlage für die Stratifikation der betroffenen Patienten und auch immer m...

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Main Author: Scheffer, Lukas
Contributors: Garn, Holger (Prof. Dr. rer. nat.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2018
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Asthma bronchiale ist eine chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege. Das betroffene Patientenkollektiv lässt sich anhand unterschiedlicher Kriterien in verschiedene Phänotypen und Endoypen einteilen. Biomarker sind Grundlage für die Stratifikation der betroffenen Patienten und auch immer mehr Entscheidungsgrundlage für die zunehmende Personalisierung der Therapie. In der vorliegenden Arbeit wurde im Rahmen eines Kooperationsprojektes zwischen dem Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie - Molekulare Diagnostik der Philipps-Universität Marburg und der DRG Instruments GmbH ein primär auf monoklonalen Maus-Antikörpern basierendes Westernblot-Nachweissystem für die humanen Transkriptionsfaktoren GATA-3 und T-Bet in humanem Vollblut entwickelt. Ein schon innerhalb der Arbeitsgruppe etabliertes Nachweissystem für GATA-3 und T-Bet in Gesamtprotein aus Zelltypen mit polyklonalen Antikörpern wurde in dieser Arbeit erfolgreich auf neue Probenmaterialien übertragen. Mit diesen Antiköpern gelang sowohl der direkte Nachweis der rekombinanten Proteine (GATA-3 und T-Bet) als auch der Nachweis der Transkriptionsfaktoren in humanem Vollblut. Mit den speziell für dieses Projekt entwickelten monoklonalen Maus-Antikörpern gelang ebenfalls der Nachweis von GATA-3 und T-Bet sowohl für die rekombinanten Proteine als auch native Proteine in humanen Vollblutproben mittels Westernblot-Nachweissystem. Sowohl mit polyklonalen als auch mit monoklonalen Antikörpern konnten Konzentrationsunterschiede entsprechend der eingesetzten Menge an Probe und auch artifizielle Konzentrationsunterschiede in mit rekombinantem Protein gespiketen Blutproben nachgewiesen werden. Eine unspezifische Signalamplifikation durch den 2. Antikörper konnte durch die Umstellung auf einen alternativen 2. Antikörper, die Reduktion der verwendeten Probenvolumina und die direkte Konjugation der monoklonalen Maus-Antiköper mit HRP vermieden werden. Im Rahmen der Sensitivitäs- und Spezifitäsprüfung der monoklonalen Maus- Antiköper zeigten sich Defizite für die α-GATA-3-Antikörper. Rekombinantes Protein eines anderen Herstellers konnte nicht detektiert werden und es zeigte sich eine Kreuzreaktivität zwischen rekombinantem Protein T-Bet und α-GATA-3-Antikörper. Durch höhere Verdünnung des Antikörpers ließ sich die Kreuzreaktivität vermeiden. Weiterführende Möglichkeiten zur Testoptimierung bezüglich der verwendeten Materialien und der Probenaufarbeitung werden im Anschluss diskutiert, ebenso wie die Einordnung des Testverfahrens in die aktuelle medizinische Forschung im Kontext der Personalisierung der Diagnostik und Therapie von Asthma bronchiale.
Physical Description:109 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2018.0342