L7Ae- and LSm-RNA interactomes of Sulfolobus acidocaldarius

Die archaealen Proteine L7Ae und LSm (Sm-ähnliche Proteine) sind universelle RNA-Bindeproteine. L7Ae stabilisiert nicht-kodierende RNAs, einschließlich ribosomaler RNA, durch Erkennung eines RNA-Strukturmotivs, namens „kink-turn“ (k-turn). Proteine der Sm-Familie, wie die bakteriellen Hfq und die eukaryotischen Sm/LSm-Proteine, sind an multiplen RNA-basierten Prozessen beteiligt, wie der Regulation der mRNA-Translation durch kleine RNAs (sRNAs), der mRNA-Degradation oder dem Spleißen von prä-mRNAs. Die Funktion der archaealen Mitglieder dieser Familie ist hingegen noch nicht geklärt. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation aller RNA-Interaktionspartner (RNA-Interaktom) von L7Ae und der drei LSm-Proteine des thermoacidophilen Archaeons Sulfolobus acidocaldarius mittels RNA-Immunopräzipitation mit anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung (RIP-Seq). Neben vielen bereits bekannten nicht-kodierenden RNAs konnte die SRP RNA als ein neuartiger Bindepartner von L7Ae identifiziert werden. Mithilfe von Mobilitätsshift-Studien konnte die Bindung von L7Ae an ein konserviertes k-turn-Motiv der archaealen SRP RNA demonstriert werden. Interessanterweise zeigte die durchgeführte RIP-Seq-Analyse eine Anreicherung diverser mRNAs, welche potentielle k-turn-Motive enthielten und somit vermutlich die Bindung durch L7Ae ermöglichten. Unter diesen mRNAs befand sich auch das l7ae-Transkript. In vivo-Studien konnten nachweisen, dass L7Ae die Translation seiner eigenen mRNA durch Bindung an ein k-turn-Motiv in der 5'-untranslatierten Region reguliert. Ein in Escherichia coli etabliertes GFP-Reportersystem bestätigte die Konservierung der L7Ae-Autoregulation in Archaeen und kann zukünftig als Werkzeug für die Erstellung synthetischer Schaltkreise verwendet werden. Mobilitätsshift-Studien zeigten die Bindung von L7Ae an ein k-turn-Motiv im nop5-fibrillarin-Transkript. Dies lässt vermuten, dass L7Ae in der Lage ist die Synthese aller C/D box sRNP-Proteinkomponenten (L7Ae, Nop5, Fibrillarin) zu regulieren. Durch diese Studien wurde die translationale Regulation von mRNAs als neue Funktion von archaealem L7Ae aufgedeckt. Die LSm-RIP-Seq-Analyse identifizierte mRNAs und sRNAs als LSm1- und LSm2-Bindepartner, einschließlich einer kürzlich entdeckten sRNA, die an der Biofilm-Herstellung in S. acidocaldarius beteiligt ist. Für das LSm3-Protein konnte keine RNA-Bindeaktivität beobachtet werden. Durch eine computergestützte Analyse der Interaktionspartner von LSm1 und LSm2 wurde das U-reiche 3'-Terminationssignal von RNAs, sowie ein aus UAG-Triplets bestehendes Motiv als potentielle LSm-Bindestellen identifiziert. Die Bindung der beiden Motive durch die LSm-Proteine wurde in Mobilitätsshift-Studien nachgewiesen. Während Deletionsstudien zeigten, dass das lsm3-Gen entbehrlich ist, scheinen die Gene für lsm1 und lsm2 Gene essentiell für S. acidocaldarius zu sein. Darüber hinaus konnte für Mutanten, die getaggte LSm1- und LSm2-Proteine synthetisierten, ein pleiotropischer Phänotyp beobachtet werden. Vergleichbar mit den Funktionen, die für das bakterielle Hfq und für die eukaryotischen LSm-Proteine beschrieben wurden, deuten die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass die archaealen LSm-Proteine an der Degradation von mRNA, der Herstellung von C/D box sRNAs und an sRNA-regulierten Prozessen wie der tRNA-Reifung und der translationalen Regulation von mRNAs beteiligt sind.