Exporling the Evolvability of Old Yellow Enzymes for Organic Synthesis

In der vorliegenden Arbeit werden Leitlinien zur Evolution flavinabhängiger Enreduktasen, eine industriell wichtige Katalysatorklasse, dargelegt. Die erarbeiteten Konzepte und Richtlinien, die allgemeingültig für diese Enzymfamilie und deren Substrate sind, könnten in zukünftigen protein-engineering-Projekten zu einer erheblichen Effizienzsteigerung führen. Der erste Teil dieser Dissertation beschäftigt sich mit einer konzeptuellen Fragestellung zur Vereinfachung von potein-engineering Studien. Im Speziellen wurden die bereits vorhandenen Kenntnisse über einzelne Enreduktasen, der Old Yellow Enyzme (OYE) Familie, die von gerichteten Evolutionsstudien herrühren, herangezogen, um diese auf den gesamten Sequenzbereich der Enzymfamilie zu übertragen. Dadurch soll die Weiterentwicklung neuer effizienterer Enreduktasen verkürzt werden. Identifizierte hotspot Positionen, wie C26D/I69T und C26G, in der Bindetasche von YqjM aus Bacillus subtilis, die für eine Aktivitätserhöhung und Stereokomplementarität verantwortlich sind, wurden in sieben weitere OYE Familienmitglieder eingebaut. Die ersten Screenings dieser neu synthetisierten Varianten mit drei unterschiedlichen Substraten zeigten jeweils stereokomplementäre Paare mit hohen Wechselzahlen von bis zu 660 h-1 und exzellenten Stereoselektivitäten bis zu >99%. Obwohl die systematische Vorhersage der absoluten Enantioselektivität für OYE-Varianten sich weiterhin als schwierig erweist, wurde die Methode des „scaffold samplings“ als schnelles Engineering-Verfahren für diese Familie bestätigt, die den Zugang zu neuen, potenten Biokatalysatoren für die organische Synthese ermöglicht. Der Fokus des zweiten Teils der Arbeit liegt auf der Entwicklung und Charakterisierung industriell interessanter Varianten der thermostabilen Enreduktase aus Thermus scotoductus SA-01 (TsER). Diese Varianten zeigen hohe Aktivitäten und Selektivitäten in industriell interessanten Prozessparametern, wie Temperaturen bis zu 70 °C, organische Lösungsmittelzusätzen von bis zu 40% (v/v) und präparative Ansätze, mit Produktisolationen von 3.8 g. Die erreichten Wechselzahlen von bis zu 40 000 h-1 sind mit denen der hetero- und homogenen Katalyse von Hydrierungen vergleichbar. Um strukturelle Einblicke in die stereoselektive Hydrierung von TsER zu erlangen, wurden in silico Studien anhand der Kristallstrukturen des Wildtyps und der Varianten C25D/I67T, C25G/I67T und C25D/I67T/A102H durchgeführt. Die umfassende Charakterisierung dieser Sammlung an thermostabilen Enreduktasen zeigt ein hohes Potential für den Einsatz in der organischen Synthese. Im dritten Teil dieser Arbeit wird das Substratspektrum auf strukturell anspruchsvollere Substanzen erweitert, im Speziellen die Klasse der Cumarine. Im Allgemeinen besteht ein großes Interesse darin den Substratbereich von Enreduktasen auf sperrige Substrate zu erweitern, um diese hochselektiven Transhydrierungskatalysatoren in einem späten Stadium der organischen Synthese komplexer Moleküle zu verwenden. Dabei wurden chemoselektive Varianten entdeckt, die zum Einen die bekannte Hydrierung katalysieren aber zum Anderen auch eine Säure/Base Aktivität in der aktiven Tasche von TsER aufweisen, wodurch das Hydrolyse Produkt des Lactones entsteht.