Ribopyranosylierte Peptide als Bausteine für den reversiblen Aufbau von Bisubstrat-Inhibitoren für die Proteinkinase A

Die Entwicklung von Bisubstrat-Inhibitoren beinhaltet Aspekte der beiden Methoden der Fragment-basierten Wirkstoffsynthese und der Übergangszustand-analogen Inhibitor-Synthese. Zwei Fragmente, die z.B. über einen Linker miteinander verknüpft werden, ahmen die natürlichen Substrate und gleichzeitig d...

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Main Author: Kirschner, Romina Anna
Contributors: Geyer, Armin (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2017
Subjects:
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Description
Summary:Die Entwicklung von Bisubstrat-Inhibitoren beinhaltet Aspekte der beiden Methoden der Fragment-basierten Wirkstoffsynthese und der Übergangszustand-analogen Inhibitor-Synthese. Zwei Fragmente, die z.B. über einen Linker miteinander verknüpft werden, ahmen die natürlichen Substrate und gleichzeitig die synthetischen Inhibitoren eines Enzyms nach und sollen durch die Doppeladressierung für mehr Wechselwirkungen mit diesem sorgen. Darüber hinaus bietet die dadurch erhoffte Steigerung der Selektivität für ein spezielles Enzym einen Vorteil gegenüber einfachen Inhibitoren, deren Spezifität sich nicht nur auf eine bestimmte Proteinkinase beschränken lässt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde neben der Entwicklung von Bisubstrat-Inhibitoren ein weiterer Aspekt in diesem Kontext erstrebt. So sollte trotz der Verfolgung einer höheren Selektivität der synthetisierten Bisubstrat-Inhibitoren über die Verwendung von kovalent reversibler Chemie die Übertragbarkeit auf andere Kinasen erleichtert werden, da häufig sehr große Ähnlichkeiten zwischen den Inhibitoren verschiedener Kinasen bestehen. Daraus resultierend wurde auf eine Verknüpfung des Substrats mit dem Inhibitor im Vorfeld verzichtet, sondern auf ein „Finden“ während der Kristallisation, aufgrund der räumlichen Nähe im Protein und der Affinität der beiden Komponenten zueinander, aufgebaut. Es sollte demnach festgestellt werden, ob der entropische Gewinn des freiwerdenden Wassers im Zuge der reversiblen Bindungsknüpfung zwischen dem Diol und der Boronsäure dafür sorgt, dass eine Veresterung in wässriger Umgebung stattfinden kann. Bevor jedoch Kristallisationsansätze und Affinitäts-Tests mit solchen Bisubstrat-Inhibitoren durchgeführt werden konnten, welche in Kooperation mit dem AK Klebe aus der pharmazeutischen Chemie stattfanden, mussten brauchbare Bausteine für die Verknüpfung beider Komponenten synthetisiert werden. Dies geschah in Anlehnung an computerbasierten Berechnungen unter Zuhilfenahme bereits vorhandener Kristallstrukturen der PKA. Zunächst erfolgte die Synthese verschiedener ribopyranosylierter Aminosäure Bausteine, indem Aminosäuren mit Hydroxy- und Thiol-Funktionen in der Seitenkette über unterschiedliche, Lewis-Säure vermittelte Glykosylierungsreaktionen mit der Tetraacetyl-geschützten Ribopyranose umgesetzt wurden (RAS). Dabei konnten insgesamt sieben verschiedene RAS-Bausteine in z. T. guten Ausbeuten erhalten werden. Die Ausbeuten der jeweiligen Synthesen lagen bei allen Bausteinen in einem Bereich, der es ermöglichte, diese sowohl in der manuellen als auch in der automatisierten Festphasenpeptidsynthese einzusetzen. Die Übertragbarkeit des Einbaus der RAS-Bausteine von kurzen Test-Sequenzen auf größere Peptide war problemlos möglich, sodass mehrere PKI-Sequenzen, mit RAS-Mutationen an verschiedenen Stellen in der Nähe des aktiven Zentrums, synthetisiert werden konnten. Für die Synthese des Inhibitors wurde die Struktur des Fasudils® als Leitmotiv gewählt, da dieses bereits als Inhibitor mit einem KD-Wert im nanomolaren Bereich bekannt ist. Daher wurden zunächst vereinfachte Sulfonamid-Bausteine synthetisiert, um die generelle Verknüpfbarkeit mit Boronsäuren zu untersuchen. Beginnend mit einem System, bei welchem die Verknüpfung des Inhibitors mit der Formylphenylboronsäure über dessen Iminierung mit einem freien Amin stattfand, wurde letztlich auf eine stabilere Verknüpfung der beiden Komponenten umgestiegen, die auf der reduktiven Aminierung der Formylphenylboronsäure mit den entsprechenden primären und sekundären Aminen beruhte. Somit konnte auch die zweite Komponente in verschiedenen Ausführungen erfolgreich synthetisiert werden, sodass anschließend die Veresterung der Zuckerbausteine mit der Boronsäure erfolgen konnte. Diese Verknüpfung wurde im Vorfeld testweise mit jedem RAS-Baustein (in Form eines entsprechenden Tetrapeptids) mit Pyrenboronsäure im NMR-Maßstab in DMSOd6 durchgeführt, sodass aufgrund der geringeren Komplexität der aufgenommenen NMR-Spektren genaue Studien zum Bindungsmodus und der Stabilität mit den jeweiligen RAS-Bausteinen angestellt werden konnten. Schließlich erfolgte die Übertragung der Verknüpfungsexperimente auf das Bisubstrat-Inhibitor-System der PKA im wässrigen Puffer, durch welche sich Kristallstrukturen erhofft wurden, in denen eine erfolgte Veresterung zu beobachten wäre. Tatsächlich jedoch wurden Kristallstrukturen erhalten, in denen keine Verknüpfung zu sehen war, da die Abstände beider Komponenten zueinander zu groß waren (siehe PDB-Codes: unveröffentlichte Dissertation Janis Müller). Ähnliche Ergebnisse wurden für die Experimente mit dem Fasudil zweiter Generation erhalten. Anhand der Kristallstrukturen konnte bestätigt werden, dass in Protein-Umgebung keine Verknüpfung der Zucker-Komponente mit dem Boronsäure-modifizierten Inhibitor stattgefunden hat, da sich die entsprechenden, für die Veresterung benötigten funktionellen Gruppen nicht nah genug kommen und wahrscheinlich auch das umgebende Protein die Beweglichkeit der beiden Komponenten beeinträchtigt. Somit bedarf es der weiteren Optimierung des Systems, wobei das größere Potential im Boronsäure-Baustein zu finden sein dürfte, da dieser mehr Möglichkeiten für eine Modifizierung bereithält. Ein Wechsel der Ribose gegen einen anderen Zucker im Aminosäure-Baustein käme ebenfalls in Frage (Versuche mit Fructose wurden durchgeführt), jedoch wäre mit Auswirkungen auf die allgemeine Syntheseroute zu rechnen, da eventuell andere Schutzgruppen am Zucker und der Aminosäure oder andere Glykosylierungs-Methoden von Nöten wären. Generell konnte jedoch gezeigt werden, dass die PKI-Sequenz die Mutation mit einem RAS-Baustein an vielen Positionen relativ gut toleriert, da die erhaltenen KD-Werte nicht für einem völligen Verlust der Affinität sprechen (außer bei PKI). Zu diesem Zeitpunkt waren jedoch die Kristallisationsversuche und Affinitätsmessungen noch nicht vollständig abgeschlossen, sodass noch einige Ergebnisse ausstehen. In weiterführenden Arbeiten müsste das System kompatibel für eine Umsetzung im wässrigen Milieu gemacht werden, da zwar die Reaktivität in DMSOd6 sehr hoch ist, in Wasser jedoch mit den verwendeten Komponenten nicht bestätigt werden konnte. Da jedoch eine Verknüpfung im Protein und somit in Puffer bzw. Wasser gewünscht ist, muss eine Optimierung der beiden Verknüpfungs-Komponenten erfolgen, die eine Übertragung der Reaktion in das wässrige System ermöglicht. Dies macht jedoch den Wechsel zu einem anderen Zucker unumgänglich, da in zahlreichen Experimenten gezeigt werden konnte, dass die pyranoide Form der Ribose in Wasser keine Umsetzung mit Boronsäuren zeigt, selbst bei Verwendung des, ausschließlich in Wasser reagierenden, Benzoboroxols. Weiterhin wurden auch andere Peptidsequenzen auf ihre Toleranz gegenüber RAS-Bausteinen getestet und ein Versuch gestartet, über den gleichzeitigen Einbau von Boronsäure und RAS-Baustein in ein Peptid eine intramolekulare Zyklisierung hervorzurufen. Der β-hairpin des Foldons zum Beispiel tolerierte die RbS-Mutationen sehr gut, da sowohl die einfache, als auch die doppelte RbS-Einbindung hohe Werte für die relative Faltungspopulation lieferten. Auch die Filaggrin Peptide mit Mutationen der beiden Serine gegen RbS bzw. des Threonins gegen RbT konnten mittels ELISA-Test positiv auf ihre Affinität gegenüber Autoantikörper rheumatoider Arthritis getestet werden. Die Versuche zur intramolekularen Zyklisierung über verschiedene Boronsäuren mit dem RbS-Baustein in diversen Heptapeptiden bzw. letztlich im β-hairpin des Foldons zeigten alle eine gewünschte Umsetzung zum zyklischen Produkt, jedoch konnte zumeist kein vollständiger Umsatz beobachtet werden. Generell erscheint die Methode jedoch geeignet, eine intramolekulare Zyklisierung in Peptiden einzuleiten. Ein ähnlicher Ansatz beinhaltete die Bildung von Makromolekülen über die Verknüpfung von Peptiden, von denen eines eine Boronsäure enthält und ein weiteres einen RAS-Baustein. Das getestete System, bestehend aus einem Ausschnitt aus der Aβ-Sequenz von Prionen-Peptiden (mit einer gekuppelten Boronsäure an die Seitenkette eines Lysins) und einem Ausschnitt aus der PKI-Sequenz (mit RbS Mutation), lieferte ebenfalls die gewünschte Verknüpfung, was mittels NMR Spektroskopie gezeigt werden konnte. Somit gelang der Zusammenschluss zweier Peptide zu einem Peptid mit einem Molekulargewicht > 3000 g/mol schlichtweg durch das Vereinen beider Peptide in einem NMR-Röhrchen in DMSOd6. Beide letztgenannten Methoden bergen noch viel Potential für die Synthese zyklischer Peptide und die Generierung von Makromolekülen, da der Einbau der benötigten Verknüpfungskomponenten während der Festphasenpeptidsynthese sehr leicht handhabbar ist und es sich bei der stattfindenden Veresterung um ein generell reversibles Verknüpfungssystem handelt. Ein weiteres verfolgtes Projekt war die Synthese von Phenylalanin-Derivaten mittels Miyaura-Borylierung über die Verwendung von Arylboronsäure-Verbindungen. Dabei konnten zwei Aminosäure Bausteine (4-Iod-Phenylalanin und 4,4‘-Biphenylalanin) erfolgreich synthetisiert und zunächst in den β-hairpin des Foldons und anschließend in die Foldon-Sequenz integriert werden. Anschließende NMR-spektroskopische Untersuchungen ergaben z. T. eine gesteigerte Stabilität der β-hairpin Struktur verglichen mit der nativen Sequenz, sodass auch auf diesem Gebiet Potential für weitere Experimente mit den genannten Aminosäure Bausteinen zu finden ist.
Physical Description:361 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2017.0669