A destabilisation domain approach to define the in vivo functional importance of PfHsp70-1 and PfHsp40 in the intraerythrocytic life cycle of Plasmodium falciparum

Table of Contents: Der apikomplexe Parasit Plasmodium falciparum ist in der Lage, Erythrozyten zu invadieren und verursacht die virulenteste Form der Malaria. Der Lebenszyklus von P. falciparum umfasst den Übergang vom poikilothermen Moskito Vektor zum warmblütigen, menschlichen Wirt und zurück. Ein solcher Wechsel bedeutet gleichzeitig einen radikalen Wechsel der zellulären Umgebung, in welcher der Parasit sich befindet und letzten Endes physiologischen Stress. Die unterschiedlichen Stressfaktoren durch die Umgebung stellen zusätzlich zu den Fieberepisoden eine Herausforderung bezüglich der Proteostase dar, was zur evolutionären Selektion eines Netzwerks unterschiedlicher molekularer Chaperone geführt hat. Tatsächlich sind einige dieser molekularen Chaperone für das Überleben von Plasmodium unabdinglich. Aufgrund der immer weiter fortschreitenden Ausbildung von Resistenzen gegenüber den verfügbaren Medikamenten kam den Hitzeschock Proteinen (Hsp) große Beachtung bezüglich der möglichen Verwendung als Angriffspunkte für neue Antimalaria Therapien zu. Plasmodium kodiert für ein Hsp90 Homolog sowie ein konstitutiv exprimiertes, hitzeinduziertes zytosolisches Hsp70 namens PfHsp70-1. Grundsätzlich interagiert Hsp70 mit dem Co-Chaperon Hsp40 und initiiert die durch die Interaktion mit Hsp90 vervollständigte Proteinfaltungsmaschinerie, welche die Proteostase in der Zelle aufrechterhält. PfHsp90 hat sich als essentiell für die intraerythrozytäre Entwicklung von P. falciparum erwiesen. Obwohl bezüglich der Biologie von PfHsp70-1 einige in vitro Studien durchgeführt wurden, existiert wenig Information bezüglich der essentiellen Funktion der Interaktion von PfHsp70- 1 und PfHsp40 in vivo. Im Zuge der hier vorliegenden Arbeit sollte in vivo die biologische Bedeutung von PfHsp70- 1 und einem seiner vorhergesagten Co-Chaperonen, PfHsp40, untersucht werden. Dazu sollte mit Hilfe von Überexpression der dominant negativen Allele, welche an die kürzlich charakterisierte Destabilisierungsdomäne (dd) gebunden wurden, der intrazelluläre Proteinlevel reguliert werden. Dabei wurde eine dominant negative Mutante von PfHsp70-1 exprimiert, welche eine Punktmutation (E187K) trägt, die die für die normale Funktion des Proteins wichtige Beweglichkeit der Domänen stark beeinflusst. PfHsp40 wurde im konservierten HPD Motiv (D34N) mutiert, welches wichtig für die Ausbildung der Interaktion mit PfHsp70-1 ist. Eine ausreichende Überexpression der episomalen dominant negativen Versionen, welche notwendig ist, um die Funktion der endogenen Proteine kompetitiv auszuschalten, war nicht möglich. Hierbei lagen die zellulären Level der endogenen Proteine um viele Stufen höher als die der episomal exprimierten dominant negativen Allele. In der Literatur wurde der Destabilisierungsansatz als erfolgreich bei der Untersuchung vieler Plasmodienproteine beschrieben. Im Gegensatz dazu konnte im Zuge dieser Arbeit bei nahezu keinem der ausgewählten Chaperone der Proteinlevel durch die Liganden FKBP oder DHFR (eine aus E. coli genutzte Destabilisierungsdomäne) kontrolliert werden. Obwohl der Level von Wildtyp PfHsp70-1 über diese Strategie reguliert werden konnte, war die dominant negative Version des Proteins mit einer mutierten Aminosäure gegenüber dem dd-Tag und Zugabe des Liganden resistent. Gleichzeitig war es möglich, die als Kontrolle fungierenden Proteine effektiv durch die stabilisierenden Liganden zu regulieren. Kürzlich konnte die erfolgreiche Nutzung des Destabilisierungsdomänen Ansatzes für konditionelle Knock-Outs verschiedener Gene gezeigt werden. Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Ergebnisse weisen im Gegensatz dazu aber auch auf die möglichen Nachteile dieser Technik hin. Wir vermuten dabei, dass der Erfolg dieses Ansatzes stark vom jeweiligen Protein abhängig ist. Die Wahl dieses Ansatzes bei der vorliegenden Arbeit basierte auf verschiedenen Veröffentlichungen, welche auf eine erfolgreiche mögliche Nutzung hindeuteten. Die Tatsache jedoch, dass es nicht möglich war, diese Strategie erfolgreich zu implementieren, verlangt ein vorsichtiges Vorgehen bei der Wahl zukünftiger Ansätze zur Untersuchung der Funktion essentieller Gene.