The role of the second messenger cyclic di-GMP in Bacillus subtilis

Der bakterielle sekundäre Botenstoff c-di-GMP repräsentiert einen integralen Schlüsselregler in der Kontrolle der bakteriellen Motilität und der Biofilmbildung. In diesem Zusammenhang korreliert eine Zunahme der intrazellulären c-di-GMP-Produktion mit einer sessilen Lebensweise, während niedrige c-di-GMP-Spiegel planktonisches Zellverhalten begünstigen. Die intrazelluläre c-di-GMP-Menge wird durch die antagonistische Aktivität von c-di-GMP-spezifischen Synthetasen (Diguanylatzyklasen, DGCs) und Hydrolasen (Phosphodiesterasen, PDEs) gesteuert. Bakterien besitzen verschiedene c-di-GMP-Bindungsrezeptoren/ Effektoren, welche die regulatorischen Funktionen dieses Signalmoleküls ausüben. Ein gegebenes bakterielles Genom kodiert typischerweise mehrere paralogische Kopien von DGCs und PDEs. Dies führt zu der Frage, wie Zellen mit einer solchen Vielzahl von Signalkomponenten zurechtkommen und garantieren, dass Spezifität innerhalb bestimmter Signalmodule vermittelt wird. Zwei allgemeine Modelle für die Signalspezifität durch funktionelle Sequestrierung werden derzeit diskutiert: die sogenannten lokalen und globalen Pool-Signal-Hypothesen. Die räumliche Sequestrierung des Signals (Pool) in Multi-Protein-Komplexe an einer bestimmten zellulären Stelle kann zu hochspezifischen Signalwegen führen. Die zeitliche und/ oder konditionale Trennung durch differentielle Expression und Aktivierung von DGCs/PDEs/ Output-Systemen könnte einen deutlicheren Einfluss auf den globalen c-di-GMP-Pool haben. Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle von c-di-GMP und seinen Spielern im Gram-positiven Modellorganismus B. subtilis, welcher eine relativ kleine c-di-GMP-Signalausrüstung aufweist. Insbesondere definieren die erhaltenen Erkenntnisse einen neuen c-di-GMP-Signalweg, der die Produktion eines unbekannten Exopolysaccharids (EPSs) reguliert. Darüber hinaus implizieren die erhaltenen Ergebnisse, dass lokale und globale Signalpools potentiell in B. subtilis operieren, um Motilität und EPS-Produktion zu regulieren. Der vorgeschlagene c-di-GMP-Rezeptor YdaK ist in dem putativen EPS-Operon ydaJKLMN kodiert. Eine künstliche YdaJ-N Induktion führt zu stark veränderten Kolonie-Biofilmen, einer erhöhten Kongo-Rot-Färbung und provoziert darüber hinaus Zellverklumpungen. Diese Beobachtungen liefern indirekte Beweise für die Produktion eines EPSs. Die mutmaßlichen EPS-Synthasekomponenten YdaM/ YdaN und YdaK co-lokalisieren vorwiegend an den Zellpolen als Cluster und sind an diesen subzellulären Stellen statisch positioniert. Dies deutet darauf hin, dass die EPS-Produktion an bestimmten Positionen der Membran stattfindet. Die potentielle Glykosylhydrolase YdaJ ist für die Erzeugung der oben beschriebenen Phänotypen nicht essentiell, während die Anwesenheit von YdaK erforderlich ist, was auf eine Beteiligung des sekundären Botenstoffs c-di-GMP hindeutet. Um die potenzielle Regulierung der EPS-Produktion durch c-di-GMP über YdaK zu untersuchen, wurden unterschiedliche Kombinationen von Überexpressions- und Deletionsmutanten des Operons bzw. von dgc Genen erzeugt. Wichtig ist, dass die Anwesenheit von dgcK für die Herstellung des unbekannten EPSs unentbehrlich war und damit eine neue Funktion für eines der drei bekannten DGC-Enzyme enthüllt wurde. DgcK und YdaK co-lokalisieren partiell an den gleichen subzellulären Positionen der Zellmembran. Dies impliziert eine direkte Nähe der Spieler und deutet in Übereinstimmung mit der lokalen Poolhypothese darauf hin, dass YdaK sein Aktivierungssignal direkt von der räumlich nahen DgcK erhält. Die zytoplasmatische DgcP-Synthetase kann DgcK durch Überproduktion komplementieren, während die dritte c-di-GMP-Synthetase, DgcW, nicht Teil des Signalweges zu sein scheint. Eine Entfernung der regulatorischen EAL-Domäne von DgcW zeigt eine andere Funktion im Bezug auf Biofilmbildung auf. Daher ist diese Studie kompatibel mit der lokalen Pool-Signal-Hypothese, zeigt aber, dass im Falle des Yda-Operons dies leicht durch Überproduktion von nicht-verwandten DGCs überwunden werden kann, sodass globale Pools vermutlich auch Signale an diese regulatorische Schaltung vermitteln können. Darüber hinaus werden in dieser Studie Hinweise vorgelegt, dass alle drei DGCs an der Hemmung der Motilität über den c-di-GMP-Rezeptor DgrA beteiligt sein könnten, was darauf hinweist, dass DgrA von global erhöhten c-di-GMP Konzentrationen abhängt.